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    自噬對(duì)低氧微環(huán)境中人肺腺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響

    2012-09-11 01:44:24李勇徐麗瑤蔡阿橋李麗芳鐘小軍
    中國肺癌雜志 2012年11期
    關(guān)鍵詞:低氧敏感性灰度

    李勇 徐麗瑤 蔡阿橋 李麗芳 鐘小軍

    放射治療是肺癌綜合治療的重要手段之一,如何減少放療抵抗、增加放療敏感性已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。低氧是肺癌等實(shí)體瘤微環(huán)境的基本特征,也是導(dǎo)致肺癌對(duì)放療產(chǎn)生抵抗的原因之一,低氧可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。近年研究[2,3]表明,自噬可增加乳腺癌、惡性腦膠質(zhì)瘤放療抵抗。然而低氧環(huán)境中自噬是否影響肺癌的放療治療效應(yīng)目前尚未完全明確。本研究通過觀察γ射線對(duì)低氧環(huán)境中不同自噬水平A549細(xì)胞的殺傷作用,初步分析保護(hù)性自噬對(duì)A549細(xì)胞放療敏感性的影響,為探討自噬對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)放療敏感性的影響的分子機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone);蛋白提取試劑盒(Pierce公司);MTT粉(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,美國Sigma公司);PCR儀(ABI公司);三氣培養(yǎng)箱(SANYO公司);蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司);透射電子顯微鏡(日本JEM-2100);直線加速器(西門子公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞(購于中科院上海細(xì)胞庫),用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37oC、5%CO2/95%空氣(常氧)飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后,根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的不同,分別接種于60 mm培養(yǎng)皿、6孔板及96孔板中培養(yǎng)12 h。更換新鮮培養(yǎng)基后置于37oC、1%O2/5%CO2/94%N2三氣培養(yǎng)箱中,繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①低氧對(duì)照組;②低氧+3-MA(5 mmol/L)組。

    1.3 電鏡下觀察自噬體的變化 取接種于60 mm培養(yǎng)皿中的A549細(xì)胞,加入3-MA(5 mmol/L)處理后繼續(xù)低氧培養(yǎng),分別于0 h,24 h,48 h用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,PBS洗3次,加入新配的4%多聚甲醛,4oC過夜。然后將細(xì)胞沉淀放入1%的四氧化鋨中,室溫固定1 h,經(jīng)一系列脫水及包埋后,固定于銅網(wǎng)上用電鏡觀察。

    1.4 Western blot檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá) 取接種于6孔板中的A549細(xì)胞, 3-MA(5 mmol/L)處理后低氧培養(yǎng),于48 h收集低氧組及低氧+3-MA組的細(xì)胞,冷PBS洗2次,加入細(xì)胞裂解液于4oC裂解20 min,12,000 r/min離心20 min,收集上清,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度。取20 μg樣品煮沸變形后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉37oC封閉2 h,一抗4oC孵育過夜,洗膜,二抗37oC孵育1 h,ECL法顯影,分析條帶灰度值,以目的條帶與β-actin調(diào)對(duì)灰度比值來表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化 取接種于96孔板中的A549細(xì)胞,加入3-MA處理24 h后給予分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy射線照射,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 20 μL,作用4 h,吸去培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL,震蕩10 min,于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%,細(xì)胞相對(duì)存活率=1-相對(duì)抑制率。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示,采用t檢驗(yàn)分析組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3-MA對(duì)低氧狀態(tài)下A549細(xì)胞的自噬水平的影響 隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)(0 h、24 h、48 h),A549細(xì)胞中自噬體形成逐漸增加;給予自噬抑制劑3-MA后,A549細(xì)胞自噬體增殖明顯減少(圖1),表明3-MA可抑制低氧狀態(tài)下A549細(xì)胞的自噬活性。

    2.2 3-MA對(duì)缺氧狀態(tài)下A549細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3蛋白表達(dá)的影響 LC3有兩種存在形式(LC3I、LC3II),前體LC3合成后經(jīng)加工形成LC3I,后者與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3II。當(dāng)自噬形成時(shí)LC3I會(huì)減少而LC3II會(huì)增加。經(jīng)圖像半定量分析灰度值(圖2),低氧組+3-MA組和低氧組LC3-I/β-actin灰度比值分別為0.71±0.03和0.51±0.01,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LC3-II/β-actin灰度比值分別為0.42±0.02和0.86±0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示,與低氧組相比,低氧+3-MA組LC3II表達(dá)水平下調(diào),LC3I表達(dá)水平上調(diào),LC3II/LC3I比值下降,表明3-MA可有效抑制缺氧狀態(tài)下A549細(xì)胞的自噬標(biāo)記蛋白的表達(dá)。

    2.3 低氧微環(huán)境下A549細(xì)胞自噬活性對(duì)放療敏感性的影響 低氧狀態(tài)下,放療+3-MA組中A549細(xì)胞增殖活性較單純放療組下降(P<0.05)(表1),表明采用自噬抑制劑3-MA下調(diào)A549細(xì)胞自噬活性后,能增強(qiáng)A549細(xì)胞的放療敏感性。

    3 討論

    自噬是細(xì)胞為適應(yīng)營養(yǎng)或生長(zhǎng)因子缺乏、低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有害刺激所發(fā)生的一種應(yīng)激反應(yīng)[4]。在氧供不足或營養(yǎng)缺乏時(shí),腫瘤細(xì)胞可通過自噬緩解細(xì)胞的代謝壓力,克服營養(yǎng)缺乏和低氧環(huán)境得以生存[5];同時(shí),自噬可選擇性地清除某些細(xì)胞成分,如受損或多余的氧自由基、DNA、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等,減少異常蛋白、細(xì)胞器的堆積,以維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)[6]。自噬作為一種防御機(jī)制,在應(yīng)激狀態(tài)下,特別是缺氧條件下對(duì)維持腫瘤細(xì)胞存活、逃避凋亡具有重要作用。

    放射治療是腫瘤最重要的治療手段之一,然而卻因腫瘤的放療抵抗而易導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和殘留。研究發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的自噬水平可影響放療敏感性。Ito等[3]證實(shí),與單純放療組相比,放療聯(lián)合自噬抑制劑(3-MA和巴佛洛霉素A)可明顯增加惡性腦膠質(zhì)瘤U373-MG細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷。Chaachouay等[2]則證實(shí),與乳腺癌放療敏感細(xì)胞株HBL-100相比,乳腺癌放療抵抗細(xì)胞株MDA-MB-231自噬活性明顯增強(qiáng),采用自噬抑制劑(3-MA和氯喹)預(yù)處理MDA-MB-231細(xì)胞,可明顯抑制其增殖活性,減少其放療抵抗。自噬與肺癌亦關(guān)系密切。Kim等[7]使用自噬抑制劑如caspase-3抑制劑(ZDEVD)和mTOR抑制劑(RAD001)能使NSCLC H460細(xì)胞增殖活性下降,凋亡增加,從而明顯增強(qiáng)H460細(xì)胞的放射敏感性,同時(shí)在小鼠荷瘤模型中觀察到,放療分別聯(lián)合Z-DEVD或RAD001,生存期較單純放療組分別延長(zhǎng)3 d和5 d 。

    圖1 低氧狀態(tài)下3-MA處理后A549細(xì)胞自噬體的變化(×6,000)Fig 1 The change of autophagosome in A549 cells after treatment with 3-MA in hypoxia condition. A: hypoxia 0 h group; B: hypoxia 24 h group;C: hypoxia 48 h group; D: hypoxia plus 3-MA 0 h group; E:hypoxia plus 3-MA 24 h group;F: hypoxia plus 3-MA 48 h group.

    圖2 低氧48 h后兩組A549細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3的表達(dá)變化Fig 2 The expression changes of LC3 protein in A549 cells after hypoxia for 48 h

    表1 低氧培養(yǎng)后不同放射劑量下自噬對(duì)A549細(xì)胞存活的影響Tab 1 The effect of autophagy on the viability of A549 cell after treatment with different radiotherapy doses in hypoxia condition

    可見,自噬調(diào)節(jié)聯(lián)合放療有望成為腫瘤治療的新策略。但目前有關(guān)肺癌與自噬關(guān)系的研究,絕大多數(shù)局限于在常氧狀態(tài)下,而在低氧微環(huán)境中,自噬影響肺癌細(xì)胞放療敏感性的研究目前僅見零星報(bào)道。

    由于肺癌等實(shí)體腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞的快速生長(zhǎng)、氧耗增加,加之血管新生紊亂,腫瘤內(nèi)部常處于低氧狀態(tài)。低氧可增加放療抵抗而使腫瘤更具有侵襲性[8],但其具體機(jī)制未明。研究表明低氧可誘發(fā)細(xì)胞自噬的發(fā)生。為了更好地模擬腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)微環(huán)境,探討自噬對(duì)低氧微環(huán)境中人肺腺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響,課題組建立了低氧培養(yǎng)條件,采用肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察不同自噬活性下A549細(xì)胞對(duì)放療射線的敏感性。

    本研究通過觀察自噬體的數(shù)量及檢測(cè)LC3的表達(dá)、分析LC3II/LC3I比值變化來判斷細(xì)胞的自噬活性。LC3蛋白是自噬體膜上標(biāo)志性蛋白,是反映自噬活性較特異的指標(biāo)。研究[9]報(bào)道,5 mmol/L 3-MA可抑制常氧環(huán)境中胃癌BGC-823細(xì)胞自噬水平,本研究證實(shí)給予3-MA(5 mmol/L)處理后,低氧環(huán)境中A549細(xì)胞自噬體數(shù)量減少,LC3II/LC3I比值下降,這表明3-MA(5 mmol/L)亦可成功抑制低氧環(huán)境中A549細(xì)胞自噬的發(fā)生。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),在不同劑量放療照射同時(shí)給予3-MA處理A549細(xì)胞,細(xì)胞相對(duì)存活率較單純放療組均有不同程度的下降。表明采用3-MA抑制自噬可增強(qiáng)A549細(xì)胞放療敏感性,但其具體分子機(jī)制尚不明確,分析可能與3-MA通過抑制bcl-2表達(dá)使腫瘤細(xì)胞凋亡增加以及3-MA通過抑制PI3K/AKT途徑進(jìn)而阻斷COX2誘導(dǎo)的凋亡抵抗[10]有關(guān),尚有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    文獻(xiàn)[11]報(bào)道,3-MA可影響腫瘤細(xì)胞增殖,且呈劑量依賴性 。本實(shí)驗(yàn)未放療組(0 Gy組)結(jié)果顯示,3-MA(5 mmol/L)處理細(xì)胞后其相對(duì)存活率較對(duì)照組呈下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,考慮本實(shí)驗(yàn)單一劑量3-MA并未完全反映其對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。本研究選用3-MA(5 mmol/L)在有效抑制細(xì)胞自噬的同時(shí),其對(duì)細(xì)胞增殖影響甚微,表明3-MA對(duì)A549細(xì)胞的放療增敏作用是通過抑制細(xì)胞自噬水平實(shí)現(xiàn)的。此外,不同濃度3-MA對(duì)A549細(xì)胞自噬及放療敏感性是否有影響,尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。本研究結(jié)果為后期探討自噬對(duì)NSCLC放療敏感性的作用的分子機(jī)制奠定了前期基礎(chǔ)。

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