異種移植抗原α-gal介導(dǎo)人血清殺傷A549細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

朱圣明 謝玲 鄭鴻 秦鳳 劉美 駱志國 王艷萍

近年來，以利妥昔單抗和曲妥珠單抗為代表的治療性單抗藥物的開發(fā)和應(yīng)用成為腫瘤分子靶向治療領(lǐng)域最為成功的代表，該類藥物以腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen, TAA）作為分子靶標(biāo)，通過與抗原結(jié)合，介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用、抗體依賴的細(xì)胞毒性等多種機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞[1-3]。然而，至今正式應(yīng)用于臨床治療的治療性單抗藥物多集中在血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌和大腸癌等少數(shù)腫瘤。其重要原因在于選擇合適的靶抗原是成功設(shè)計(jì)與開發(fā)腫瘤治療性單抗的前提和關(guān)鍵，而目前除了少數(shù)腫瘤之外，大部分腫瘤尤其是高復(fù)發(fā)率腫瘤的TAA很難明確，即便是在TAA較清楚的少數(shù)腫瘤，由于腫瘤細(xì)胞間存在的異質(zhì)性和腫瘤患者個(gè)體差異性使得針對(duì)TAA單抗藥物的開發(fā)和應(yīng)用受到了限制[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，一些腫瘤研究者開始嘗試通過基因治療手段，重新在人腫瘤細(xì)胞上合成人類不表達(dá)的異種抗原，利用人體天然存在的免疫體系，誘導(dǎo)了一系列有效的抗腫瘤效應(yīng)，顯示出良好的應(yīng)用前景。

α-gal是廣泛存在于豬、牛、鼠等非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類碳水化合物表位。在物種進(jìn)化的過程中，由于負(fù)責(zé)催化合成α-gal的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的移碼突變和無意義突變，人體不能合成α-gal，但人體天然預(yù)存著大量針對(duì)α-gal的抗體，這些抗體能特異性識(shí)別并結(jié)合外源性α-gal表位。移植免疫學(xué)研究證實(shí)[5]，誘發(fā)豬-人器官移植過程中超急性免疫排斥反應(yīng)的關(guān)鍵因素正是在于，表達(dá)在豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上的α-gal能同人體天然存在的α-gal抗體迅速結(jié)合，通過CDC途徑引起移植物細(xì)胞的溶解和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。這提示，利用α-1,3GT的基因?qū)耄谀[瘤細(xì)胞上重新合成α-gal，構(gòu)建能被人體天然抗體識(shí)別且特異性結(jié)合的異種靶標(biāo)，有可能介導(dǎo)類似于異種移植排斥反應(yīng)的抗腫瘤效應(yīng)。本研究通過轉(zhuǎn)基因手段建立穩(wěn)定表達(dá)異種移植抗原α-gal的人肺癌細(xì)胞系，探討α-gal誘導(dǎo)的人血清抗體/補(bǔ)體系統(tǒng)免疫激活機(jī)制，以期為腫瘤生物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5和已知α-gal陽性表達(dá)的豬髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PIEC均由四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤分子診斷實(shí)驗(yàn)室提供，用含有15%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。pEGFP-N1-GT[6]是CMV啟動(dòng)子調(diào)控的α-1,3GT基因表達(dá)質(zhì)粒為本課題組在前期工作中構(gòu)建。DMEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamineTM2000、Trizol總RNA提取試劑盒購自Invitogen公司。熒光素標(biāo)記的植物凝集素（FITC-BSIB4）為Vector公司產(chǎn)品。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、新霉素衍生物G418購自美國Promega公司。高保真DNA聚合酶KODPlus DNA polymerase購自日本Toyobo公司。MTT購自美國Sigma公司。熒光素標(biāo)記的羊抗人IgM（FITC-anti-IgM）及羊抗人C3（FITC-anti-C3）均購自北京中杉金橋公司。健康人混合型血清為四川大學(xué)華西醫(yī)院中心血庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37oC、5%CO2條件下，用含10%小牛血清的DMEM常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞A549、MRC-5和PIEC細(xì)胞。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞A549細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%時(shí)，按照lipofectamineTM2000說明書將pEGFP-N1-GT轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。48 h后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以1:5傳代，同時(shí)換用400 mg/mL的G418細(xì)胞篩選培養(yǎng)基，G418的濃度隔日增加100 mg/mL，維持G418濃度為800 mg/mL至3周后形成單克??；共挑取10個(gè)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并間歇給予400 mg/mL的G418，在此期間，每月利用直接熒光免疫染色法檢測(cè)細(xì)胞表面α-gal的表達(dá)，經(jīng)篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)α-gal的A549細(xì)胞命名為A549-GT。下述實(shí)驗(yàn)均采用轉(zhuǎn)染24個(gè)月后的A549-GT細(xì)胞，并將A549細(xì)胞作為其母本對(duì)照組，將無啟動(dòng)子的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549-p1-GT，作為平行對(duì)照組。

1.2.3 α-1,3GT基因mRNA的表達(dá)檢測(cè) 按照Trizol總RNA提取操作方法，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA。以總RNA為模板，利用RT-PCR的方法檢測(cè)上述細(xì)胞中α-1,3GT mRNA的表達(dá)。根據(jù)GenBank中豬α1,3-GT的序列（NM_213810）及內(nèi)對(duì)照（人GAPDH）的序列設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)1：5'-TCAATGCTGCTTGTCTCA -3，R1：5'-TAAGTGCCTTCCCATA-3'（擴(kuò)增300 bp的α-1,3GT片段）；F2：5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'，R2：5'-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'（擴(kuò)增395 bp的GAPDH片段）逆轉(zhuǎn)錄后，PCR條件為94oC預(yù)變性2 min，94oC 30 s，50oC 30 s，72oC 2 min，33個(gè)循環(huán)，72oC后延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 A549-GT細(xì)胞上α-gal抗原表位的表達(dá)檢測(cè) 植物凝集素（BS-IB4 lectin）能與α-gal特異性結(jié)合，故本實(shí)驗(yàn)采用熒光素標(biāo)記的凝集素（FITC-BS-IB4 lectin）檢測(cè)96孔板轉(zhuǎn)染細(xì)胞中α-gal的表達(dá)。在96孔板中接種細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液以1:50稀釋BS-IB4 lectin，向每孔加入50 μL稀釋液，室溫避光20 min。在熒光倒置顯微鏡下每月1次檢測(cè)細(xì)胞上α-gal的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：另取一定數(shù)量細(xì)胞分至EP管中，1%BSA洗細(xì)胞3次；每4×105細(xì)胞加入含8 μg BS-IB4lectin的1%BSA液300 μL，4oC避光1.5 h；1%多聚甲醛固定，4oC避光30 min；1%BSA洗3次；加入300 μL 1%BSA，重懸，上機(jī)檢測(cè)，以A549細(xì)胞為陰性對(duì)照，每組重復(fù)3次。

1.2.5 α-gal在A549-GT細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性檢測(cè) 取6孔板，在同一孔中接種105個(gè)A549-GT和105個(gè)MRC-5細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h；另取一孔，接種105個(gè)MRC-5細(xì)胞，12 h后，PBS清洗細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶中A549-GT細(xì)胞培養(yǎng)液稍加離心后，上清加入MRC-5細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按1.2.4方法，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表面α-gal的表達(dá)情況。

1.2.6 A549-GT與血清IgM和血清補(bǔ)體C3結(jié)合分析

1.2.6.1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞與人血清中IgM的結(jié)合情況 在96孔板中接種細(xì)胞，PBS洗3次。以下過程均在4oC下進(jìn)行。2%多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次。每孔加入人血清100 μL，4oC靜置1 h。吸去血清，PBS洗3次。每孔加入50 μL用DMEM液按1:50稀釋的羊抗人FITC-anti-IgM，靜置30 min，PBS洗3次。以A549細(xì)胞為陰性對(duì)照，熒光倒置顯微鏡下觀察人血清中IgM與細(xì)胞的結(jié)合情況。

1.2.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與人血清中IgM的結(jié)合情況 消化細(xì)胞分至EP管中，1%多聚甲醛4oC固定細(xì)胞30 min；1%BSA洗2次；加入用DMEM稀釋的80%的人血清300 μL，懸浮細(xì)胞，37oC，1 h；1%BSA洗3次；用DMEM按1:50稀釋羊抗人FITC-anti-IgM，按每1×106細(xì)胞加入稀釋液200 μL，4oC，避光靜置30 min。1%BSA洗3次；加入300 μL 1%BSA，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，以A549細(xì)胞為陰性對(duì)照，重復(fù)3次。

1.2.6.3 分別參照步驟1.6.1和1.6.2中轉(zhuǎn)染細(xì)胞與血清IgM結(jié)合的分析方法，將羊抗人FITC-IgM改為羊抗人FITC-anti-C3，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與血清補(bǔ)體C3的結(jié)合情況。

1.2.7 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞形態(tài)觀察 按1×104個(gè)/孔在96孔板上接種A549、A549-G、A549-p1-GT細(xì)胞，每種細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。5%CO2、37oC培養(yǎng)。分別在細(xì)胞接種24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h后取上述96孔板中細(xì)胞，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），37oC繼續(xù)培養(yǎng)4 h；去上清后每孔加入DMSO150 μL，570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值；統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所測(cè)得數(shù)據(jù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)過程中，光鏡下觀察A549、A549-G細(xì)胞的形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549-GT 中α-1,3GT mRNA的表達(dá) RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳分析顯示：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系A(chǔ)549-GT細(xì)胞中有α-1,3GT mRNA的表達(dá)，而A549細(xì)胞及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549-p1-GT則無（圖1），細(xì)胞傳代24個(gè)月后重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍能得到同樣的結(jié)果。

2.2 A549-GT細(xì)胞中α-gal的表達(dá) 直接免疫熒光染色法觀察結(jié)果顯示：A549-GT和PIEC細(xì)胞中有較強(qiáng)的熒光，A549細(xì)胞中無熒光（圖2）；FCM分析顯示：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24個(gè)月后A549-GT陽性表達(dá)細(xì)胞達(dá)（80.1±3.2）%，陽性對(duì)照細(xì)胞PIEC上α-gal的表達(dá)率達(dá)80%，對(duì)照組母本細(xì)胞A549的陽性細(xì)胞百分比僅（1.1±0.8）%。

圖1 A549-GT細(xì)胞中α-1,3GT mRNA的表達(dá)Fig 1 The expression of α-1,3GT mRNA in A549-GT cells. M: marker；1-4: A549-GT； 5,6: A549； 7,8: A549-p1-GT.

圖2 A549-GT細(xì)胞中α-gal表達(dá)免疫熒光觀察（×200）及流式細(xì)胞分析Fig 2 Immunofluorescence observation and FCM analysis of the expression of α-gal on A549-GT. A: A549； B: PIEC； C: A549-GT.

圖3 α-gal的表達(dá)對(duì)A549轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài)（×100）及增殖的影響Fig 3 The effects of α-gal on the morphology and proliferation of A549 transfected cells. N: A549-GT； a: A549.

2.3 A549-GT的細(xì)胞生物學(xué)特性 在常規(guī)培養(yǎng)上述細(xì)胞的過程中，顯微鏡下觀察到：穩(wěn)定表達(dá)α-gal的A549-GT細(xì)胞與A549細(xì)胞之間細(xì)胞形態(tài)沒有明顯差異。MTT檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)α-gal的A549-GT細(xì)胞生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)曲線結(jié)果（圖3）顯示，A549細(xì)胞及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549-p1-GT和A549-GT細(xì)胞增殖速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 α-1,3GT對(duì)周圍正常細(xì)胞的影響 A549-GT細(xì)胞與MRC-5共培養(yǎng)以及A549-GT培養(yǎng)基與MRC-5共培養(yǎng)24 h后，植物凝集素的直接免疫熒光結(jié)果顯示：兩種培養(yǎng)方式均只在A549-GT細(xì)胞上觀察到熒光，MRC-5細(xì)胞無熒光（圖4），說明α-1,3GT牢固地錨定在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)，對(duì)周圍正常細(xì)胞未產(chǎn)生“旁觀者”效應(yīng)。

2.5 A549-GT細(xì)胞與血清IgM和血清補(bǔ)體C3的結(jié)合 細(xì)胞經(jīng)健康人血清處理，再與FITC-anti-IgM共同孵育后，熒光倒置顯微鏡下觀察到：表達(dá)α-gal的A549-GT細(xì)胞膜上有大量的熒光，而不表達(dá)α-gal的A549細(xì)胞膜上則僅見本底性結(jié)合（圖5）。FCM分析結(jié)果顯示：A549和A549-GT經(jīng)血清處理后細(xì)胞膜上檢測(cè)到的平均熒光強(qiáng)度分別為4.68±0.22、45.9±0.46。細(xì)胞經(jīng)人血清處理，與FITC-anti-C3共同孵育后，熒光倒置顯微鏡下觀察到：A549-GT細(xì)胞膜上有大量FITC-anti-C3的沉積，而A549細(xì)胞膜上則僅見本底性結(jié)合（圖5）。FCM分析結(jié)果顯示：A549和A549-GT經(jīng)血清處理后細(xì)胞膜上檢測(cè)到的平均熒光強(qiáng)度分別為4.5±0.17、37.5±0.36。

3 討論

α-gal（Galα-1,3Gal-β1-4-GlcNAc-R）是細(xì)胞表面糖蛋白和糖酯上Galα(1-3)Gal雙糖末端殘基結(jié)構(gòu)，廣泛表達(dá)于除人、猿和古世紀(jì)候之外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，是由α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3GT）負(fù)責(zé)催化合成。在生物進(jìn)化過程中，由于基因突變，α-1,3GT功能失活，不能合成α-gal。Lanteri等[7]克隆了人α-1,3GT基因并與小鼠α-1,3GT基因做比對(duì)，結(jié)果證實(shí)，兩者在基因結(jié)構(gòu)上具有相似性，但由于強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的提前出現(xiàn)，使得人α-1,3GT mRNA只轉(zhuǎn)錄出4個(gè)截短的外顯子區(qū)，而缺失了兩個(gè)具有催化功能的外顯子區(qū)，這導(dǎo)致了人截短的、無功能的α-1,3GT假基因的形成。本研究，將前期建成功的CMV啟動(dòng)子調(diào)控的α-1,3GT基因真核表達(dá)載體pEGFPN1-GT轉(zhuǎn)染A549后，RT-PCR顯示正常人肺腺癌細(xì)胞A549中無α-1,3GT基因表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因細(xì)胞A549-GT中有大量α-1,3GT mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。植物凝集素（BS-IB4）具有與α-gal表位特異結(jié)合的特點(diǎn)，植物凝集素標(biāo)記下的直接免疫熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)均檢測(cè)到A549-GT細(xì)胞中有豐富的α-gal合成，而A549中無α-gal合成，這提示人體因α-1,3GT假基因的存在不表達(dá)α-gal，但有可能利用基因?qū)氲姆椒ǎ瑢⑼庠葱驭?1,3GT基因?qū)肴四[瘤細(xì)胞，重新在腫瘤細(xì)胞上合成α-gal。國內(nèi)外也有一些研究者借助基因重組技術(shù)，首先通過昆蟲、病毒和細(xì)菌等生物容器中獲取a-1,3GT，再用神經(jīng)氨酸酶處理腫瘤細(xì)胞，最后與尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）共孵，在腫瘤細(xì)胞表面合成α-gal表位，但這些方法不僅步驟繁瑣、產(chǎn)量不高，且在人體應(yīng)用過程中，殘留的病毒蛋白和細(xì)菌內(nèi)毒素可能給患者帶來不必要的損傷[8-10]。

圖4 α-1,3GT對(duì)周圍正常細(xì)胞的影響Fig 4 The effect of α-1,3GT on normal cell

圖5 熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞分析A549-GT細(xì)胞與血清中IgM/C3的結(jié)合Fig 5 The binding of A549-GT on IgM/C3 by fluorescence microscope and FCM

為探討α-gal表位在腫瘤細(xì)胞中的重新合成對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究通過MTT增殖實(shí)驗(yàn)比較了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞A549-GT及其親本細(xì)胞A549的增殖活性，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯差別。與本研究結(jié)果一致的是，Xing等[11]發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和人肺癌細(xì)胞上合成α-gal改變了細(xì)胞表面能與VVA，PNA等相互作用的碳鏈結(jié)構(gòu)，而腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度并沒有受到明顯的影響。Aubert等[12]報(bào)道，表達(dá)α-gal的胰腺癌細(xì)胞Bx-αGT.9和PcαGT.2與其母本細(xì)胞的生長(zhǎng)速度沒有明顯差別，但卻修飾了細(xì)胞表面碳鏈結(jié)構(gòu)，改變了細(xì)胞表面其它與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)的碳水化合物殘基結(jié)構(gòu)，可能會(huì)改變胰腺癌癥細(xì)胞之間及同周圍基質(zhì)的粘附能力，甚至降低胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。隨后，研究者利用金倉鼠細(xì)胞系HaP-T1做了類似的研究，結(jié)果得到相同的結(jié)論[13]。

α-1,3半乳糖苷基轉(zhuǎn)移酶位于細(xì)胞高爾基體，為一典型的II型跨膜蛋白，包含一短的胞質(zhì)尾區(qū)、一跨膜區(qū)、一主干區(qū)和一個(gè)羧基末端催化區(qū)，有學(xué)者以可溶形式表達(dá)了α-1,3GT截短的催化結(jié)構(gòu)域，同樣可以在腫瘤細(xì)胞表面合成α-gal表位[10]，但若將這種可溶的α-1,3GT用于人腫瘤治療，則可能使得周圍的正常細(xì)胞產(chǎn)生“旁觀者”效應(yīng)，本研究將α-1,3GT全長(zhǎng)基因克隆至表達(dá)載體，不僅能在腫瘤細(xì)胞上長(zhǎng)期穩(wěn)定合成α-gal，而且轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其培養(yǎng)基分別與正常人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5共培養(yǎng)，均不能使MRC-5獲得α-gal合成能力，這說明α-1,3GT在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)的錨定具有牢固性，不會(huì)輕易脫落“感染”周圍正常組織，增加了其應(yīng)用于人體時(shí)的靶向性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，α-1,3GT酶活性穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞24個(gè)月后仍能大量合成α-gal表位，且α-gal未被人體其它酶類消化掉，保證了其穩(wěn)定性和有效性。

雖然人體不能合成α-gal表位，但正如遠(yuǎn)古時(shí)代人類祖先能對(duì)表達(dá)α-gal的感染性微生物產(chǎn)生防御一樣，人類對(duì)α-gal并不耐受，作為對(duì)棲身于胃腸道且表達(dá)α-gal的微生物的免疫應(yīng)答，正常人從嬰兒開始，由占循環(huán)總量1%的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量針對(duì)α-gal的天然抗體（anti-gal），包括IgG、IgM和IgA[14]。已有的研究[15]表明：由于α-gal表位缺乏唾液酸且完全沒有靜電電荷，anti-gal抗體對(duì)α-gal的結(jié)合具有非常高的特異性，它只能結(jié)合到細(xì)胞表面糖脂的α-gal殘基上，而不能結(jié)合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面其它碳水化合物表位上[16]。異種器官移植免疫研究顯示，導(dǎo)致移植物超急期排斥反應(yīng)的主要機(jī)制是人血清中抗α-gal抗體與豬組織細(xì)胞上α-gal特異性結(jié)合，激活了補(bǔ)體系統(tǒng)，在移植物細(xì)胞膜上形成膜攻擊復(fù)合體，裂解表達(dá)α-gal的豬組織細(xì)胞，導(dǎo)致器官移植失敗。為此，國內(nèi)外一些研究者正積極尋求克服這種排斥反應(yīng)的有效手段，如培育α-1,3GT基因敲除豬等[17]。本研究反向思維，通過基因?qū)胧侄卧谌四[瘤細(xì)胞上重新合成了α-gal表位，以期模擬HAR機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。在本實(shí)驗(yàn)中，分別向A549-GT和A549細(xì)胞中加入正常人血清，再與熒光素標(biāo)記的抗IgM抗體（FITC-anti-IgM）共孵育后，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)均檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞A549-GT細(xì)胞膜上有大量anti-gal抗體結(jié)合，而A549細(xì)胞膜上則無結(jié)合，且人血清天然抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合依賴于腫瘤細(xì)胞上α-gal的表達(dá)。

Aubert等[13]發(fā)現(xiàn)，表達(dá)a-gal的Bx-aGT9和PC-aGT2細(xì)胞不僅能引起anti-gal抗體與之結(jié)合，還能進(jìn)一步誘導(dǎo)與之結(jié)合的anti-gal抗體上補(bǔ)體因子的大量結(jié)合。為進(jìn)一步證實(shí)表達(dá)a-gal的肺癌細(xì)胞與血清抗體結(jié)合后能否激活補(bǔ)體系統(tǒng)，本研究將A549-GT細(xì)胞和正常人血清共同孵育，熒光素標(biāo)記的補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：穩(wěn)定表達(dá)α-gal的A549-GT細(xì)胞膜上有大量補(bǔ)體C3的結(jié)合，而不表達(dá)α-gal的A549細(xì)胞膜上則未見熒光。這提示，利用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)手段向人肺癌細(xì)胞中導(dǎo)入功能性α-1,3GT基因，為人血清中天然抗體攻擊腫瘤細(xì)胞構(gòu)建特異性靶標(biāo)，可能誘導(dǎo)血清抗體的結(jié)合及補(bǔ)體的激活，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。Unfer的研究小組[18]將表達(dá)a-gal的MC38細(xì)胞與人血清共同孵育，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒殺傷實(shí)驗(yàn)顯示：與50%人血清共同孵育的表達(dá)a-gal的MC38細(xì)胞有98%被裂解。Yoshimura等[19]在肝癌和胰腺癌細(xì)胞上觀察到同樣的現(xiàn)象。郭軍[20]的研究報(bào)道，將穩(wěn)定表達(dá)α-gal的胃癌細(xì)胞株GC9811與不同濃度的人血清孵育后，觀察到GC9811細(xì)胞能被不同濃度的血清有效的裂解，且裂解作用具有血清濃度依賴性。

和其它腫瘤自殺基因、凋亡基因用于腫瘤基因治療一樣，將α-1,3GT基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中也需面臨靶向性問題，假設(shè)α-gal抗原在腫瘤之外的正常組織中表達(dá)，不僅會(huì)產(chǎn)生類似異種器官移植的強(qiáng)烈排斥反應(yīng)，使正常組織受到損傷，還會(huì)增強(qiáng)正常人體細(xì)胞的免疫原性，引起嚴(yán)重的自身免疫性疾病，如Graves'病等[21,22]。因此，積極探索靶向性更強(qiáng)的基因表達(dá)方式是開發(fā)α-gal用于腫瘤基因治療必須解決的難題之一。但國內(nèi)外的大多數(shù)研究者似乎并沒有對(duì)這種嚴(yán)重后果給予足夠的重視。Lanteri的課題組將長(zhǎng)約250 bp的neu基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)α-1,3GT基因在C-erb高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中靶向表達(dá)α-gal表位[23]。在前期工作中，課題組成功構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子調(diào)控α-1,3GT基因的真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了α-1,3GT基因在肺癌細(xì)胞中靶向合成α-gal。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)通過基因?qū)胧侄文軌蚴功?1,3GT持續(xù)、穩(wěn)定地在腫瘤細(xì)胞上合成α-gal。然而，hTERT啟動(dòng)子活性相對(duì)較弱，如何將有效性與靶向性完美的結(jié)合是今后研究的一個(gè)方向，將增強(qiáng)子和hTERT啟動(dòng)子聯(lián)合、CMV/SV40啟動(dòng)子和hTERT啟動(dòng)子聯(lián)合，或者合成人工hTERT啟動(dòng)子可能是較好的思路之一[24,25]。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過基因?qū)胧侄螌惙N移植抗原α-gal引入到腫瘤細(xì)胞上，觀察到了人血清處理后抗體/補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，這為腫瘤生物治療提供了全新的思路，但α-gal誘導(dǎo)的人血清抗腫瘤效果及靶向性問題都需要進(jìn)一步的研究和探討。