抑制Src酪氨酸激酶活性對(duì)人肺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥性及MDR1和LRP表達(dá)的影響

律潔 田玉峰

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是臨床肺癌化療治療失敗的主要原因，克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是癌癥治療中亟需解決的問題。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是一個(gè)復(fù)雜的過程，導(dǎo)致藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積減少或藥物靶部位的濃度降低，細(xì)胞抗凋亡能力的增強(qiáng)[1]。耐藥基因的激活與表達(dá)增加已被證實(shí)與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)，其中多藥耐藥蛋白（multidrug resistance 1, MDR1）和肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistancerelated protein, LRP）是目前研究較多的耐藥機(jī)制，二者的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)或藥物靶部位藥物濃度有密切的關(guān)系。研究[2]證明，直接或間接地抑制MDR1和LRP的活性或表達(dá)可增加細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。

Src是一種分子量為60 kDa的酪氨酸激酶，是細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases, PTKs）中的膜相關(guān)Src家族激酶（Src family kinases, SFKs）成員，是最有代表性的非受體酪氨酸激酶之一[3]，在調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均發(fā)揮了重要作用[4]。大量研究[5]表明，Src酪氨酸激酶在多種腫瘤組織或細(xì)胞中呈現(xiàn)異?；罨默F(xiàn)象，已經(jīng)被證明與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管新生密切相關(guān)，是一個(gè)潛在的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。最近，Src酪氨酸激酶因被發(fā)現(xiàn)與腫瘤多藥耐藥密切相關(guān)而備受關(guān)注，研究[6]表明抑制Src酪氨酸激酶活性可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，但是其機(jī)制還不完全清楚，正在引起人們的廣泛關(guān)注，值得深入研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉購(gòu)自AstraZeneca公司，磷酸化Src單抗、MDR1和LRP單抗購(gòu)自SantaCruz，Rh-123和CellTiter-Glo試劑盒購(gòu)自Promega，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP于5%CO2、37oC、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，以RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 CellTiter-Glo發(fā)光法檢測(cè)Src酪氨酸激酶抑制劑對(duì)A549/DDP增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞，以5×104/mL接種到96孔微孔板中，每孔100 μL，37oC、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。對(duì)應(yīng)試驗(yàn)孔加入濃度為0 μM、2.5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM 4-苯胺喹唑啉，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，按照CellTiter-Glo試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞活性，即將細(xì)胞裂解后，轉(zhuǎn)至遮光96孔板，加入ATP誘導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)試劑，混勻，10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光值。

1.2.3 CellTiter-Glo發(fā)光法檢測(cè)Src酪氨酸激酶抑制劑對(duì)A549/DDP細(xì)胞毒作用的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞，以5×104/mL接種到96孔微孔板中，每孔100 μL，37oC、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。對(duì)應(yīng)試驗(yàn)孔加入濃度為0 μM、2.5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM順鉑，在此基礎(chǔ)上加入0 μM、2.5 μM或10 μM 4-苯胺喹唑啉，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，按照CellTiter-Glo試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rh-123濃度的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞，加入2.5 μM或10 μM 4-苯胺喹唑啉，不加入4-苯胺喹唑啉做對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μM Rh-123染液（10μL）繼續(xù)培養(yǎng)1 h。收集細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中Rh-123的平均熒光強(qiáng)度，考察細(xì)胞中Rh-123的含量。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)MDR1和LRP的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入2.5 μM或10 μM Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉，不加入4-苯胺喹唑啉做對(duì)照，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用Trizol法提取各組總RNA，用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，MDR1上游引物序列：5'-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3'，下游引物序列：5'-GCACAAAATACACCAACAA-3'；LRP上游引物序列：5′-AGTCAGAAGCCGAGAAAG-3′，下游引物序列：5′-CCCAGCCACAGCAAGGT-3′；以β-actin為內(nèi)參，上游引物序列：5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物序列：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。94oC變性3 min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95oC 5 s，65oC 35 s，72oC 60 s，循環(huán)后72oC延伸5 min。

1.2.6 Western blot檢測(cè)MDR1和LRP的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞，加入2.5 μM或10 μM 4-苯胺喹唑啉，不加入4-苯胺喹唑啉做對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞裂解提取蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質(zhì)用12% SDS-PAGE法進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，分別用MDR1抗體（1:800）和LRP抗體（1:500）孵育，4oC過夜，以特異性的辣根過氧化物酶連接的二抗溫育1 h，洗滌，顯示免疫反應(yīng)條帶，以β-actin作為內(nèi)參（Sigma，1:2,000）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Src酪氨酸激酶抑制劑對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響CellTiter-Glo實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4-苯胺喹唑啉對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，通過細(xì)胞抑制曲線得出4-苯胺喹唑啉在2.5 μM時(shí)對(duì)A549/DDP細(xì)胞無明顯毒性（抑制率＜5%），在10 μM時(shí)有微弱毒性（抑制率10%-15%）（圖1），因此本研究選擇2.5 μM及10 μM 4-苯胺喹唑啉進(jìn)行研究。

圖 1 Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響和對(duì)藥物敏感性的逆轉(zhuǎn)作用Fig 1 The effect of 4-anilinoquinazoline on A549/DDP cells proliferation and reversal effect of drug sensitivity

2.2 抑制Src酪氨酸激酶活性可提高A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性 CellTiter-Glo實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2.5 μM和10 μM的4-苯胺喹唑啉可降低順鉑抑制A549/DDP的IC50值，順鉑抑制A549的IC50值為12.64 μM，A549/DDP的IC50值為52.61 μM，而2.5 μM 4-苯胺喹唑啉作用后順鉑對(duì)A549/DDP的IC50值為33.15 μM，10 μM 4-苯胺喹唑啉作用后順鉑對(duì)A549/DDP的IC50值為24.98 μM，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal fold, RF)分別為1.59倍和2.10倍（圖1）。

2.3 抑制Src酪氨酸激酶活性可提高A549/DDP細(xì)胞中Rh-123的含量 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Src酪氨酸激酶抑制劑處理后A549/DDP細(xì)胞中的Rh-123含量明顯提高，2.5 μM和10 μM 4-苯胺喹唑啉處理的腫瘤細(xì)胞中Rh-123的平均熒光強(qiáng)度分別比對(duì)照組細(xì)胞提高了1.21倍和1.59倍（圖2），證明抑制Src酪氨酸激酶活性可降低腫瘤藥物外排，提高腫瘤細(xì)胞中藥物含量，從而提高腫瘤細(xì)胞藥物敏感性。

圖 2 抑制Src酪氨酸激酶活性對(duì)A549/DDP細(xì)胞內(nèi)Rh-123蓄積的影響Fig 2 The effect of Src tyrosine kinase activity on the intracellular accumulation of rhodamine-123 in A549/DDP cells. A: The figure of the effect of Src tyrosine kinase activity on the mean fluorescence intensity of rhodamine-123 in A549/DDP cells; B: A graph representing the analysis of intracellular rhodamine-123 mean fluorescence intensity.Data presented are Mean±SD values from at least three independent experiments. Bars indicate SD.*, compared to control group, P＜0.05.

2.4 抑制Src酪氨酸激酶活性可下調(diào)MDR1和LRP基因轉(zhuǎn)錄RT-PCR結(jié)果顯示，2.5 μM和10 μM 4-苯胺喹唑啉處理后，A549/DDP細(xì)胞的MDR1基因的mRNA水平分別為對(duì)照組的53.8%和27.5%，LRP基因的mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的59.3%和21.4%（圖3），證明抑制Src酪氨酸激酶活性可下調(diào)腫瘤細(xì)胞MDR1和LRP基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低上述蛋白表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞藥物敏感性。

圖 3 抑制Src酪氨酸激酶活性對(duì)A549/DDP細(xì)胞MDR1和LRP mRNA表達(dá)的影響。Fig 3 The effect of Src tyrosine kinase activity inhibition on the mRNA expression of MDR1 and LRP in A549/DDP cells. Data presented are Mean±SD values from at least three independent experiments. Bars indicate SD.*, compared to control group,P＜0.05. MDR1: muti-drug resistance 1; LRP: lung resistancerelated protein.

2.5 抑制Src酪氨酸激酶活性可下調(diào)MDR1和LRP蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)顯示，4-苯胺喹唑啉可降低A549/DDP細(xì)胞MDR1和LRP的蛋白水平，且呈現(xiàn)劑量依賴性（圖4），證明抑制Src酪氨酸激酶活性可下調(diào)腫瘤細(xì)胞MDR1和LRP蛋白表達(dá)，從而提高腫瘤細(xì)胞藥物敏感性。

圖 4 抑制Src酪氨酸激酶活性對(duì)A549/DDP細(xì)胞MDR1和LRP蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effect of Src tyrosine kinase activity inhibition on the protein expression of MDR1 and LRP in A549/DDP cells

3 討論

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性是臨床應(yīng)用化療藥物治療腫瘤失敗的主要原因，研究腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的機(jī)制及解決方法對(duì)提高化療藥物的臨床有效性具有重要意義。研究[7]顯示，腫瘤細(xì)胞可通過多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥性：過表達(dá)ATP結(jié)合盒蛋白超家族（ATP-binding cassette protein super family）等跨膜蛋白基因，將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物被泵出，減少細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度；過表達(dá)具有解毒和 DNA修復(fù)功能的酶，使細(xì)胞毒藥物效果減低；下調(diào)藥物靶點(diǎn)分子表達(dá)，降低藥物敏感性；激活抑癌基因，抑制藥物所致的細(xì)胞凋亡等。其中，被廣泛研究的機(jī)制是多藥耐藥蛋白MDR1及肺耐藥相關(guān)蛋白LRP高表達(dá)所引起的耐藥性，這些蛋白的表達(dá)降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)或者藥物靶附近的藥物濃度，導(dǎo)致給予的藥物無法有效地到達(dá)治療部位，從而產(chǎn)生耐藥性[8]。

PI3K-AKT通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的增殖和生存中起著重要作用，在不同類型的腫瘤中均可見此信號(hào)通路的過度表達(dá)[9]，已有研究[10]表明PI3K/Akt路徑的活化是腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物耐受的關(guān)鍵調(diào)控因素。Src酪氨酸激酶活化后，可激活下游PI3K-AKT信號(hào)通路，活化下游相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過磷酸化IKKα/β蛋白，提高NF-κB活性，促進(jìn)MDR1和LRP基因的轉(zhuǎn)錄。

MDR1是能量依賴性跨膜糖蛋白，在肺癌組織中廣泛表達(dá)，在正常肺組織中低水平表達(dá)或不表達(dá)。MDR1蛋白具有藥泵功能，當(dāng)腫瘤細(xì)胞膜上過度表達(dá)MDR1蛋白時(shí)，MDR1可結(jié)合抗腫瘤藥物，通過ATP水解后釋放的能量，主動(dòng)將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，產(chǎn)生耐藥[11]。

LRP近年來被發(fā)現(xiàn)是重要的耐藥基因，在肺癌中首先發(fā)現(xiàn)，是一種穹隆體主蛋白，在多種耐藥細(xì)胞株中均有過度表達(dá)。LRP可參與組成核孔復(fù)合物（nuclear pore complex,NPC）參與細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間物質(zhì)交換以及細(xì)胞質(zhì)中的囊泡運(yùn)輸。LRP比MDR1更早地表達(dá)在惡性腫瘤中，給予低濃度化療藥后即可見到LRP表達(dá)增加，而不需要高濃度化療藥刺激，其過度表達(dá)通過調(diào)節(jié)囊泡和核質(zhì)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)將藥物儲(chǔ)存于囊泡，減少其在核與胞質(zhì)間的比例，可影響藥物的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與分布而導(dǎo)致耐藥[12]。

由人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549連續(xù)暴露于順鉑后篩選出的耐藥A549/DDP細(xì)胞除耐受順鉑外，還對(duì)VP-16和CBP交叉耐藥，研究[13]顯示該細(xì)胞的多藥耐藥性與MDR1和LRP的高表達(dá)密切相關(guān)，是一株良好的工具細(xì)胞。Src酪氨酸激酶在腫瘤形成和發(fā)展中的重要性已經(jīng)被人們所熟知，Src的異?；罨瘜?dǎo)致了細(xì)胞的癌變并賦予腫瘤細(xì)胞存活的能力[14]。同時(shí)，最近的研究[15]顯示Src激酶還參與腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物，Src酪氨酸激酶抑制劑可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，甚至逆轉(zhuǎn)耐藥性。Src酪氨酸激酶與腫瘤耐藥性的關(guān)系并不十分清楚，Src酪氨酸激酶抑制劑在不同類型腫瘤耐藥細(xì)胞上的作用值得深入研究。

本研究顯示，Src抑制劑4-苯胺喹唑啉可抑制A549/DDP細(xì)胞中Src的激酶活性，表現(xiàn)為Src自身磷酸化水平降低，并且CellTiter-Glo試驗(yàn)顯示這種抑制作用可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。A549/DDP細(xì)胞耐藥性的主要機(jī)制之一是MDR1和LRP過表達(dá)，使得細(xì)胞外排藥物的能力增加導(dǎo)致藥物在細(xì)胞中的濃度降低，因而其耐藥性的逆轉(zhuǎn)很可能與藥物在細(xì)胞中的蓄積得以恢復(fù)有關(guān)。Rh-123作為MDR1的底物，可以指示細(xì)胞中該蛋白的功能強(qiáng)弱，并指示癌細(xì)胞對(duì)藥物的外排作用，因此我們利用流式細(xì)胞術(shù)研究了Src抑制劑對(duì)細(xì)胞Rh-123含量的影響。結(jié)果顯示，在Src抑制劑處理后，細(xì)胞的Rh-123含量明顯提高，說明抑制Src酪氨酸激酶活性逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的耐藥性與其抑制藥物的外排、提高藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積有關(guān)，與我們的推測(cè)一致。進(jìn)一步的Western blot研究顯示，抑制Src酪氨酸激酶活性下調(diào)了細(xì)胞MDR1和LRP蛋白的表達(dá)水平，與Rh-123含量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。而real-time PCR研究顯示，抑制Src酪氨酸激酶活性下調(diào)MDR1和LRP蛋白的表達(dá)很可能是通過降低mRNA的轉(zhuǎn)錄水平來實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)制可能是抑制Src酪氨酸激酶活性后，PI3K-AKT路徑受到阻斷，從而下調(diào)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活性，降低了MDR1和LRP mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

綜上所述，本研究顯示抑制Src酪氨酸激酶活性可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞多藥耐藥性，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞MDR1和LRP的表達(dá)，恢復(fù)藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積有關(guān)。本研究結(jié)果為靶向作用Src的藥物運(yùn)用與臨床逆轉(zhuǎn)MDR1或LRP介導(dǎo)的肺癌多藥耐藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。