OAT在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析

周丹菲 程西安 楊拴盈 明宗娟 李維 張秋紅 張玉萍

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。因其缺乏有效的早期診斷方法[2]，70%-80%的患者確診時(shí)已是腫瘤中晚期，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然目前的治療方式不斷進(jìn)步和發(fā)展，但是肺癌患者的預(yù)后仍不盡人意，5年和10年生存率分別為14%和8%[3,4]。早期診斷和早期治療是改善患者預(yù)后、降低肺癌死亡率的關(guān)鍵。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選肺癌早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是近期研究的熱點(diǎn)，但是至今尚無理想的生物標(biāo)志物。本課題前期通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選出一系列差異蛋白。其中鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ornithine aminotransferase, OAT）在肺腺癌A549細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞16HBE間的表達(dá)差異超過2倍。通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OAT可能和肝細(xì)胞癌、胃癌、前列腺癌等其它腫瘤也存在相關(guān)性，而其與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究將進(jìn)一步利用細(xì)胞和組織標(biāo)本分別對(duì)OAT mRNA和OAT蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證前期線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果并分析其臨床意義。此外，利用生物信息學(xué)方法對(duì)OAT蛋白進(jìn)行初步分析和相互作用蛋白預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步探究其在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及組織來源 人肺腺癌細(xì)胞株A549來自西安交通大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室保存；人正常支氣管上皮細(xì)胞株16HBE購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫；55例肺癌組織標(biāo)本取自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2006年-2011年手術(shù)病例，其中17例同時(shí)收集癌旁＞5 cm處肺組織標(biāo)本，其中男性35例，女性20例，鱗癌35例，腺癌20例，27例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，28例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，平均年齡為（58.3±10）歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009年第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期20例，II期15例，III期18例，IV期2例。所有入選病例術(shù)前未經(jīng)放、化療，無肝硬化、自身免疫病等合并癥，術(shù)后經(jīng)病理確診為肺癌。組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片備用。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青-鏈霉素溶液（美國Hyclone）；0.25%胰蛋白酶溶液（上海碧云天）；RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒（上海飛捷）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Fermentas）；OAT及actin-beta引物（上海生工）；PCR mix（北京康為世紀(jì)）；溴化乙錠溶液、DNA Marker I、焦碳酸二乙酯（北京天根生化）；瓊脂糖粉（西班牙Biowest）；兔抗人OAT多克隆抗體（美國Abcam）；免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、中性樹膠（北京中杉金橋）；其它實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及RT-PCR A549和16HBE細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d-3 d后用0.25%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按RNAfast200試劑盒步驟進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。利用RNA電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度法測(cè)定OD260/OD280值進(jìn)行RNA定量。cDNA合成按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作說明進(jìn)行：在PCR管中加入2 μL總RNA，1 μL隨機(jī)引物，再加入RNase free H2O至總體積為12 μL，混合均勻后經(jīng)65oC加熱5 min，迅速置于冰上，再依次加入5×Reaction buffer 4 μL、RNase inhibitor 1 μL、10 mM dNTP mix 2 μL、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL使總體積為20 μL，震蕩混勻離心后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：42oC 60 min，70oC 5 min，最后終止反應(yīng)得到cDNA產(chǎn)物，-20oC保存?zhèn)溆?。PCR過程：將目的基因的退火溫度從48oC-60oC之間每隔1oC設(shè)立溫度梯度進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)模板cDNA濃度、引物量及循環(huán)數(shù)等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，最終確立最佳PCR反應(yīng)條件。

OAT的PCR擴(kuò)增體系如下：1:100稀釋后cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94oC、3 min；94oC、30 s，52oC、30 s，74oC、45 s，循環(huán)35次；74oC、5 min。

Actin-beta的PCR擴(kuò)增體系如下：1:1,000稀釋后cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94oC、3 min；94oC、30 s，52oC、30 s，74oC、45 s，循環(huán)35次；74oC、5 min。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)電泳并采集凝膠圖像，利用Gel-Pro專業(yè)圖像分析軟件，測(cè)定各條帶的積分光密度值（integrated optical density, IOD），以actin-beta為內(nèi)參，計(jì)算A549和16HBE細(xì)胞系中OAT mRNA的相對(duì)含量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 組織化學(xué)染色 過程如下：脫蠟和水化、微波枸櫞酸抗原修復(fù)、3% H2O2孵育、正常山羊血清封閉、一抗（OAT 1:30稀釋）4oC過夜、二抗孵育、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明并封片。用已知陽性片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定[3]：由兩位病理醫(yī)師采取雙盲法進(jìn)行判斷，OAT蛋白以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野。采用半定量積分法判定結(jié)果，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比（＜5%：0分；5%-24%：1分；25%-50%：2分；＞50%：3分）和染色強(qiáng)度（未著色：0分；淡黃色：1分；中度黃色：2分；棕黃色：3分）進(jìn)行評(píng)分。將兩種分值相加：0分為“-”，1分-2分為“+”，3分-4分為“++”，5分-6分為“+++”。我們將“-”定義為陰性，將“+、++、+++”定義為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，采用χ2檢驗(yàn)分析組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)OAT mRNA、蛋白質(zhì)序列進(jìn)行搜索，在此基礎(chǔ)上，利用ProtParam、BLAST、SOPMA、TMpred、SMART、WoLF PSORT、SWISS-MODEL Repository、NetPhos 2.0 Server[4]和ProtFun 2.2 Server[5]等在線工具和軟件對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、蛋白同源性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、功能結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、三維結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)和功能等進(jìn)行初步分析。利用IntAct、APID、MINT、DIP、STRING等蛋白質(zhì)相互作用在線數(shù)據(jù)庫，分析預(yù)測(cè)可能和OAT存在相互作用的蛋白。在DAVID（The Database for Annotation,Visualization, and Integrated Discovery）平臺(tái)上對(duì)篩選出來的相互作用蛋白進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能注釋和信號(hào)通路分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA定量及完整性鑒定 由A549所提取細(xì)胞總RNA的OD260/OD280值在1.95-2.07之間，RNA濃度平均值為255.9 ng/μL。16HBE細(xì)胞總RNA的OD260/OD280值在1.92-2.04之間，RNA濃度平均值為374.1 ng/μL，表明所提取總RNA的純度較高。1%瓊脂糖凝膠電泳清晰可見28S、18S兩條帶（圖1），無明顯雜帶或拖尾現(xiàn)象，且28S亮度約為18S的2倍，表明所提取總RNA的完整性較好，基本無降解。

2.2 RT-PCR結(jié)果 OAT基因在A549細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示，肉眼可見A549組所對(duì)應(yīng)條帶與16HBE組相比較暗，經(jīng)Gel-Pro軟件測(cè)定各條帶的積分光密度值（IOD），以actin-beta為內(nèi)參，計(jì)算A549和16HBE細(xì)胞株中OAT基因mRNA的相對(duì)含量分別為0.20±0.05和0.57±0.07， A549組中OAT基因mRNA的相對(duì)含量較低，兩者差異約為2.85倍。

2.3 免疫組化結(jié)果 OAT蛋白以棕黃色顆粒表達(dá)于胞漿，在NSCLC組織中表達(dá)陽性率為81.82%（45/55），而在癌旁肺組織中均無陽性表達(dá)（χ2=39.080, P＜0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。OAT表達(dá)為“-”、“+”、“++”和“+++”的分別有10例、27例、10例和8例（圖4）。按性別、年齡、組織病理學(xué)類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及TNM分期對(duì)NSCLC進(jìn)行分組分析，結(jié)果顯示OAT蛋白在腺癌和鱗癌組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.169, P=0.023）。OAT蛋白在肺腺癌組中的陽性率（100%）高于其在肺鱗癌組中的陽性率（71.43%）。而OAT蛋白的表達(dá)和患者性別、年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及TNM分期無關(guān)。

2.4 生物信息學(xué)結(jié)果 OAT基因具有兩個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本，分別編碼兩個(gè)不同的線粒體亞型蛋白；該基因在人類、猩猩、黑長(zhǎng)臂猿、小鼠、大鼠、大熊貓和牛等物種間高度保守，具有較高的同源性；OAT蛋白分子量為48,534.8，理論pI為6.57，主要由亮氨酸（10.5%）、丙氨酸（8.4%）、甘氨酸（8.2%）和纈氨酸（8.0%）等組成，是一種偏向親水性的，較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋（42.14%）和無規(guī)則卷曲（29.16%）（圖5）；TMpred結(jié)構(gòu)域分析軟件顯示OAT蛋白可能并不存在跨膜結(jié)構(gòu)域；SMART數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果提示該蛋白具有結(jié)合磷酸吡哆醛和氨基轉(zhuǎn)移活性的aminotran-3結(jié)構(gòu)域；OAT蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)也證實(shí)了本研究前期實(shí)驗(yàn)中線粒體蛋白的指向；NetPhos 2.0 Server預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)結(jié)果提示OAT蛋白可能存在7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和9個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖6）；圖7所示是OAT的三維結(jié)構(gòu)圖，它是利用SWISS-MODEL Repository 的搜索功能，并整合SMTL、 RCSB 、PDBe 、 SCOP和CATH數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)所得。初步對(duì)OAT蛋白的功能預(yù)測(cè)提示其可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面具有一定的作用（表1）。

通過搜索IntAct、MINT、DIP、InteroPorc和STRING等在線數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)存在重復(fù)和冗余數(shù)據(jù)，為了獲得相對(duì)可靠的相互作用蛋白，進(jìn)一步將具有文獻(xiàn)依據(jù)的相互作用蛋白總結(jié)如下（表2），表中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的獲取方式有：免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化和酵母雙雜交等。

STRING數(shù)據(jù)庫的結(jié)果（圖8，圖中著色節(jié)點(diǎn)表示和OAT可能直接相關(guān)的分子，白色節(jié)點(diǎn)代表可能存在更深層次關(guān)系的分子，節(jié)點(diǎn)間連線以不同的顏色分別代表不同的依據(jù)來源，下方表中詳細(xì)羅列了各著色節(jié)點(diǎn)的相關(guān)信息及綜合評(píng)分）則進(jìn)一步擴(kuò)大了相互作用的預(yù)測(cè)范圍，該數(shù)據(jù)庫包含了直接（物理上）和間接（功能上）的各種相互作用關(guān)系，數(shù)據(jù)結(jié)果綜合了基因背景、高通量實(shí)驗(yàn)、共表達(dá)和已知信息等，并對(duì)每一個(gè)相互作用關(guān)系進(jìn)行評(píng)分，該數(shù)據(jù)庫目前涵蓋了來自1133個(gè)物種的5,214,234種蛋白質(zhì)的相互作用信息。STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)所得與OAT相互作用蛋白中評(píng)分最高的20種蛋白依次為：OTC、ARG1、ARG2、ALDH18A1、ODC1、ALDH4A1、ASS1、ASL、ACY1、TBC1D25、TNF、TLR4、SLC22A6、SLC22A8、IL2、SLC22A7、B3GAT1、GLUD2、GLUL、SCL22A20。

表 1 OAT基因功能初步分析結(jié)果Tab 1 The functional prediction of OAT Gene

表 2 具有文獻(xiàn)依據(jù)的OAT相互作用蛋白及相關(guān)信息Tab 2 The binary interactions of OAT in literature

綜合各數(shù)據(jù)庫信息，篩選出54種可能和OAT存在相互作用的蛋白質(zhì)并提交至DAVID在線平臺(tái)，其中52種蛋白質(zhì)在DAVID中查找到對(duì)應(yīng)的ID，通過Gene Ontology對(duì)這52種蛋白質(zhì)進(jìn)行本體論注釋，在相應(yīng)參數(shù)設(shè)置條件下，發(fā)現(xiàn)共有35種蛋白質(zhì)參與了73種不同的生物學(xué)途徑（biological process），20種蛋白質(zhì)參與了14種不同的細(xì)胞組件（cellular component），27種蛋白質(zhì)參與了18種不同的分子功能（molecular function）。分子信號(hào)通路分析結(jié)果（圖9）顯示有17種蛋白質(zhì)參與了包括：NF-κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路及精氨酸和脯氨酸代謝等在內(nèi)的8個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

圖 1 細(xì)胞提取總RNA電泳結(jié)果Fig 1 Electrophoresis of total RNA extracted from cell lines

圖 2 OAT基因PCR電泳結(jié)果Fig 2 Electrophoresis of OAT gene PCR product

圖 3 OAT蛋白在肺鱗癌（A）、肺腺癌（B）和癌旁肺組織（C）中的表達(dá)（IHC，×400）Fig 3 The expression of OAT in squamous lung cancer (A), adenocarcinoma (B) and adjacent non-tumor lung tissue (C) ( IHC, ×400)

3 討論

OAT蛋白由位于染色體10q26的OAT基因編碼，以同源四聚體的形式存在于線粒體基質(zhì)，存在兩種同工酶，分別為肝型和腎型。在OAT的催化作用下，鳥氨酸可轉(zhuǎn)化為谷氨酸，后者可進(jìn)一步生成脯氨酸和谷氨酰胺，在氨基酸的生物合成和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用。該酶首先以前體的形式在細(xì)胞質(zhì)中合成，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體后裂解為成熟的OAT蛋白質(zhì)。OAT基因遺傳缺陷可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳疾病——脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜環(huán)狀萎縮[6]。對(duì)于OAT和腫瘤的相關(guān)研究，前期多為檢測(cè)動(dòng)物模型或細(xì)胞中該酶活性的改變。其中關(guān)于肝細(xì)胞腫瘤[7,8]、下頜下腺癌[7]、淋巴瘤[8]等的相關(guān)研究提示：隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，OAT的酶活性明顯下降。但是近年來有研究顯示在Morris肝細(xì)胞瘤中OAT的含量較正常肝臟高15倍[9]、肝癌組織中的OAT基因定量高于非肝癌組織[10]，且可能是肝臟β-catenin信號(hào)通路[11]及前列腺癌中雄激素受體[12]的靶向基因。此外，研究還發(fā)現(xiàn)OAT是腫瘤細(xì)胞紡錘體組裝的必需成分，通過抑制OAT，可以干擾細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[13]。近期，Miyasaka等[14]在采用238pu α粒子照射人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化早期R15H20細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)OAT蛋白高表達(dá)。Cadoret等[15]在誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中CapG蛋白高表達(dá)的同時(shí)也檢測(cè)到了OAT蛋白的表達(dá)上調(diào)。Jariwala等[16]在轉(zhuǎn)移性犬乳腺癌中發(fā)現(xiàn)OAT蛋白表達(dá)上調(diào)超過1.5倍。Wang等[17]通過蛋白質(zhì)組學(xué)和RTPCR的研究結(jié)果均表明：經(jīng)過己烯雌酚處理后的前列腺癌細(xì)胞中OAT表達(dá)上調(diào)，此外，還有多個(gè)凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)的線粒體蛋白質(zhì)在經(jīng)歷己烯雌酚處理后也發(fā)生了表達(dá)量的變化。由此，研究者推測(cè)己烯雌酚誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但對(duì)于OAT和其它相關(guān)蛋白的確切功能尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

圖 4 OAT蛋白在肺癌組織中的表達(dá)情況示意圖Fig 4 The expression of OAT in lung cancer tissues

圖 5 SOPMA軟件對(duì)OAT二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig 5 The secondary structure prediction result of OAT by SOPMA

本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)OAT基因在不同細(xì)胞間的表達(dá)差異進(jìn)行比較，結(jié)果顯示肺腺癌細(xì)胞中OAT基因mRNA相對(duì)含量低。而免疫組化進(jìn)行蛋白表達(dá)差異的比較，發(fā)現(xiàn)NSCLC中OAT蛋白表達(dá)顯著高于癌旁肺組織，這個(gè)結(jié)果和前期線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致。對(duì)于OAT基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平不一致的原因分析可能為：①在mRNA到蛋白質(zhì)表達(dá)的過程中，存在轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后各環(huán)節(jié)的精細(xì)調(diào)控，涉及mRNA的出核過程、細(xì)胞漿定位、穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后水解、加工等，這些都可能造成轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的豐度不一致[18,19]；②體外細(xì)胞培養(yǎng)和患者手術(shù)組織標(biāo)本之間的差異所致；③RT-PCR和免疫組化在定量上都無法達(dá)到精確的程度，這是實(shí)驗(yàn)方法本身存在的缺陷；④實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)及標(biāo)本量少所造成的局限。

本研究中OAT基因在NSCLC和對(duì)照組間的表達(dá)差異是肯定的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肺腺癌組織中OAT蛋白的表達(dá)高于肺鱗癌。雖然肺腺癌和鱗癌都起源于支氣管上皮細(xì)胞，但兩者在組織形態(tài)和生物學(xué)行為方面仍存在較大的差異。腫瘤的形成是在多種因素的影響下發(fā)生的細(xì)胞癌變，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OAT在肺腺癌中的表達(dá)高于肺鱗癌，提示OAT的表達(dá)可能與細(xì)胞病理類型的分化相關(guān)，對(duì)NSCLC的病理分型、治療方案選擇和預(yù)后判斷可能有一定的價(jià)值。此外，OAT蛋白表達(dá)與患者TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等臨床病理特征無關(guān)，提示其可能是NSCLC形成過程中的早期事件。由此，我們認(rèn)為OAT有望成為NSCLC的早期診斷標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)。

圖 6 OAT蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig 6 The result of phosphorylation sites prediction of OAT

圖 7 OAT蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖Fig 7 The three-demensional structure of OAT protein

圖 8 STRING數(shù)據(jù)庫：OAT相互作用蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果Fig 8 Predicted functional partners of OAT in STRING database

圖 9 17種蛋白質(zhì)基于KEGG和BIOCARTA數(shù)據(jù)庫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果Fig 9 The signal pathway analysis of 17 proteins based on KEGG and BIOCARTA databases

為進(jìn)一步研究OAT在NSCLC中的功能和作用機(jī)制，我們期望通過相互作用蛋白的篩選來對(duì)OAT的功能進(jìn)行初步闡述。目前研究蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法主要有酵母雙雜交、哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交、免疫共沉淀、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、串聯(lián)親和純化、蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜等，這些技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用領(lǐng)域做出了重大的貢獻(xiàn)，但是實(shí)驗(yàn)研究也存在一定的缺陷，通常需要特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和條件，操作過程復(fù)雜，需要大量資金和人力的投入。生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，綜合了計(jì)算機(jī)科學(xué)和應(yīng)用數(shù)學(xué)的方法而形成的一門新興學(xué)科。在基因組和蛋白質(zhì)組研究獲得了大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，生物信息學(xué)在數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存、分析、檢索和共享等層面發(fā)揮了不可替代的作用。本研究通過整合多種數(shù)據(jù)庫和軟件功能，在對(duì)OAT進(jìn)行初步分析的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)其相互作用蛋白并分析可能參與的生物過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，TNF和TRAF6是兩種可能和OAT存在相互作用的蛋白，它們參與了NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路是目前已知的重要的腫瘤相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外，其他可能和OAT存在相互作用蛋白多涉及物質(zhì)合成、腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長(zhǎng)調(diào)控等重要生物過程。這間接提示了OAT蛋白可能通過參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而在NSCLC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，為深入研究其在NSCLC中的作用機(jī)制提供了一個(gè)新的思路。