鐘巍 王孟昭 李龍蕓 夏瑩 陳閩江 張力 趙靜
晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的治療主要以化療為主,包括一線化療和二線化療,可以延長患者的生存期和改善生活質量。近年來,表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)的出現(xiàn)使患者生存期進一步延長,甚至部分患者可以長期生存。研究[1,2]表明EGFR-TKI的療效與EGFR基因的突變情況明顯相關,特別是外顯子19的缺失突變和外顯子21的點突變。這兩種突變占所有敏感突變的90%以上。本研究回顧性地總結了北京協(xié)和醫(yī)院2007年1月-2009年12月3年間收治的NSCLC患者EGFR基因檢測結果和基因突變對吉非替尼治療療效和不良反應的影響。
1.1 對象 均為就診于北京協(xié)醫(yī)院的患者,符合以下條件:≥18歲;均有組織學證實為非鱗癌的NSCLC;有足夠的組織標本進行EGFR基因突變檢測;臨床分期為IIIb期或IV期;患者病例資料完整。共收集患者160例,其中111例接受了吉非替尼治療。
1.2 試驗方法 收集患者的臨床資料,包括所有患者的性別、年齡、吸煙情況、組織類型和ECOG體能評分。對于接受吉非替尼治療的患者收集病例相關資料,包括:既往化療方案數(shù),是否有骨轉移、腦轉移、肝臟轉移、其它肺葉轉移和胸腔積液,吉非替尼治療的客觀療效、疾病進展時間和死亡時間以及治療相關的不良反應(包括皮疹、腹瀉、食欲下降、肝臟轉氨酶升高和惡心/嘔吐等)??陀^療效評價根據(jù)實體瘤療效評價標準(Response Evalutation Criteria in Solid Tumor, RECIST)進行評估。無疾病進展生存期(progression free survival, PFS)定義為從開始服用吉非替尼到疾病進展或患者死亡的時間(月),生存期(overall survival, OS)定義為從開始服用吉非替尼到患者死亡的時間(月)。
1.3 EGFR基因檢測方法 所有組織標本均為患者進行治療前經(jīng)病理科醫(yī)生確定為NSCLC的組織石蠟包埋切片。本研究采用限制性內(nèi)切酶法聯(lián)合巢式PCR法對EGFR基因外顯子19和21進行突變檢測,該法之前已經(jīng)進行了報道[3]。本研究采用的方法對之前方法稍作改進。腫瘤DNA提取采用磁珠法(北京金麥格生物技術有限公司),引物序列(表1)由上海Invitrogen公司合成。最終PCR產(chǎn)物由上海Invitrogen公司完成測序,使用DNAMAN軟件閱讀序列。
巢式PCR及酶切條件如下:①巢式PCR第一輪(PCR1):反應體系:10 μL,包括DNA聚合酶及反應混合物GoTaq mix 5 μL、上下游引物(10 pm/μL)各0.5 μL、基因組DNA 5 ng-100 ng,無核酸水補齊至10 μL;反應條件:95oC 5 min;95oC 30 s,60oC 30 s,72oC 30 s,20個循環(huán);72oC 10 min。②酶切富集突變(參見MseI或MscI說明書):體系為20 μL,取1 μL第一輪PCR反應產(chǎn)物,使用MseI(對于外顯子19)或MscI(對于外顯子21)0.5 μL,10×Buffer 1 μL,無核酸水補齊至20 μL;酶切條件:37oC 4 h。③巢式PCR第二輪(PCR2):反應體系:50 μL,包括DNA聚合酶及反應混合物GoTaq mix 25 μL、上下游引物(10 pm/μL)各3 μL、模板DNA(即PCR1產(chǎn)物酶切后的DNA)2 μL,核酸游離水補齊至50μL;反應條件:95oC 5 min;95oC 30 s,60oC 30 s,72oC 30 s,40個循環(huán);72oC 10 min。
1.4 統(tǒng)計方法 使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組患者中位OS和中位PFS的比較采用Kaplan-Meier方法計算。采用多因素Cox回歸分析各種因素對生存期的影響,包括性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數(shù)、骨轉移、腦轉移、肝臟轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變情況。計數(shù)資料采用χ2檢驗分析包括不同亞組患者EGFR基因突變率的差異和不同亞組吉非替尼治療的客觀療效,多因素分析采用線性回歸的方法進行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 一般情況 2007年1月-2009年12月共160例非鱗癌的NSCLC患者接受了EGFR基因突變的檢測,其中男性81例,女性79例;年齡<60歲91例,≥60歲69例;吸煙58例,不吸煙102例;ECOG 0分-1分119例,≥2分41例;非腺癌17例,腺癌143例。111例接受了吉非替尼治療,其中15例為一線治療,96例為二線治療。
2.2 EGFR基因突變與臨床特征的關系 160例患者共檢測到EGFR基因突變88例(55%),其與患者臨床特征的關系見表2,可見是否有EGFR基因突變只與病理類型相關。多因素分析也顯示只有病理類型與是否有突變明顯相關(χ2=6.374, P=0.023),而其它因素無統(tǒng)計學意義。88例EGFR基因突變中,外顯子19缺失突變41例,外顯子21點突變47例。突變類型與患者臨床特征的關系見表3,單因素分析和多因素分析均未見任何患者臨床特征與突變類型有關。
2.3 EGFR基因突變與OS和PFS的關系 EGFR基因突變患者的OS為29.0個月(95%CI: 24.2-33.8);而野生型患者的OS為21.0個月(95%CI: 14.7-27.3),兩者差異無統(tǒng)計學意義(P=0.066)(圖1)。EGFR基因突變患者的PFS為17.0個月(95%CI: 5.6-17.6);而野生型患者的PFS為11.6個月(95%CI: 8.6-25.4),兩者有明顯差異(P=0.022)(圖2)。
表 1 突變富集PCR引物、復性溫度及產(chǎn)物長度Tab 1 The ME-PCR primers, annealing temperatures and the lengths of the products
表 2 EGFR基因突變與患者臨床特征的關系Tab 2 The relationship of EGFR mutation statuses and clinical characteristics
2.4 OS和PFS的影響因素分析 分析性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數(shù)、骨轉移、腦轉移、肝轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變對總生存期的影響。多因素分析結果見表4。結果顯示只有ECOG評分、病理類型和EGFR基因突變狀態(tài)與OS相關。
分析性別、年齡、吸煙狀況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數(shù)、骨轉移、腦轉移、肝轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變對PFS的影響。多因素分析結果見表5。結果顯示ECOG評分、既往化療方案數(shù)和EGFR基因突變與PFS明顯相關。
2.5 客觀療效的影響因素分析 分析客觀療效的影響因素包括年齡、性別、吸煙情況、ECOG評分、病理類型、既往化療方案數(shù)、骨轉移、腦轉移、肝臟轉移、其它肺葉轉移、胸腔積液和EGFR基因突變狀態(tài)(表6),單因素分析顯示吉非替尼的客觀療效與性別、吸煙情況、骨轉移和EGFR基因突變狀態(tài)明顯相關。而多因素分析顯示客觀療效只與突變狀態(tài)(χ2=10.976, P=0.004)和吸煙情況(χ2=21.10,P<0.001)相關,而其它因素無統(tǒng)計學意義。EGFR基因突變患者的客觀有效率為43.3%(26/60),而疾病控制率為95%(57/60),高于EGFR基因野生型的患者,分別為21.6%(11/51)和76.5%(39/51)。
表 3 各種EGFR基因突變類型的臨床特征Tab 3 The clinical characteristics of patients with EGFR exon 19 and 21 mutations
表 4 總生存期的Cox多因素分析Tab 4 Multivariate analysis of over survial
2.6 EGFR基因外顯子19突變與外顯子21突變的差別 外顯子19缺失突變患者的OS為30.0個月(95%CI: 24.2-35.8);外顯子21點突變患者的OS為28.0個月(95%CI: 23.2-32.8),兩者無明顯差異(χ2=0.103, P=0.748)(圖3)。外顯子19缺失突變患者的PFS為17.0個月(95%CI: 5.5-28.5);外顯子21點突變患者的PFS為16.5個月(95%CI: 3.9-29.1),兩者無明顯差異(χ2=0.060, P=0.807)(圖4)。
60例EGFR基因突變患者中外顯子19缺失突變?yōu)?8例,外顯子21點突變?yōu)?2例。外顯子19缺失突變患者的客觀有效率為42.8%(12/28),疾病穩(wěn)定率為53.6%(15/28),疾病進展為3.6%(1/28);而外顯子21點突變患者的客觀有效率為43.8%(14/32),疾病穩(wěn)定率為50%(16/32),疾病進展為6.2%(2/32),兩組的療效無明顯差異。
圖 1 EGFR基因野生型和突變型患者的OS曲線Fig 1 The OS curves of the EGFR mutation positive and negative patients. OS: overall survival.
圖 2 EGFR基因野生型和突變型患者的PFS曲線Fig 2 The PFS curves of the EGFR mutation positive and negative patients. PFS: progression free survival.
圖 3 EGFR基因外顯子19缺失突變和21點突變患者的OS曲線Fig 3 The OS curves of the patients with EGFR exon 19 and 21 mutations
圖 4 EGFR基因外顯子19缺失突變和21點突變患者的PFS曲線Fig 4 The PFS curves of the patients with EGFR exon 19 and 21 mutations
表 5 PFS的Cox多因素分析Tab 5 Multivariate analysis of progression free survival
2.7 不良反應 患者使用吉非替尼的不良反應較少,主要為皮疹和腹瀉,發(fā)生率分別為48.6%(54/111)和18.9%(21/111),但多數(shù)為輕度不良反應,不需要處理和停止吉非替尼治療(表7)。EGFR基因野生型和突變型患者的不良反應無明顯差別。
EGFR-TKI是近年來NSCLC治療中最重要的進展,特別是發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變與EGFR-TKI的療效明顯相關[1,2]。普遍認為非鱗癌患者EGFR突變率較高,所有的非鱗癌患者都建議接受EGFR基因突變檢測。本研究檢測了160例非鱗癌的NSCLC,結果發(fā)現(xiàn)突變率達到55%,與相關文章報道相似[4]。IPASS試驗[5]中進行EGFR基因突變檢測的患者中突變陽性率為60%(261/437),該試驗入組的患者都是腺癌和不吸煙或輕微吸煙的患者,而且EGFR基因突變中外顯子19和外顯子21突變所占的比例為90%以上。本研究發(fā)現(xiàn)在臨床指標中,僅有病理類型和突變相關,腺癌的突變率高于大細胞肺癌和不能分型的NSCLC。
吉非替尼是最早研發(fā)的EGFR-TKI,本研究顯示EGFR基因突變患者的PFS明顯優(yōu)于EGFR基因野生型患者,與文獻報道一致。在IPASS試驗[5]中發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變陽性的患者的PFS為9.5個月,而野生型患者僅為1.5個月。這個差別遠大于本研究,可能與IPASS試驗是一線治療試驗,即患者之前未接受過化療,而本研究的患者大部分都是化療后才接受了吉非替尼的治療有關。多數(shù)文章[5-12]均報道EGFR基因突變不僅是EGFR-TKI的療效預測因素,也是患者生存的預后因素。在吉非替尼的一線治療IPASS試驗[5]中,EGFR基因突變患者的總生存期為21.6個月,而野生型為11.2個月;二線治療INTEREST試驗[6]中分別為14.2個月和6.4個月。本研究中兩組的總生存期分別為29.0個月和21.0個月,雖然兩組總生存期有8個月的差異,但未達到統(tǒng)計學差異。其原因可能為兩組的總生存期都很長并且兩組患者例數(shù)偏少。
多因素分析顯示OS的影響因素為ECOG評分和病理類型,PFS的影響因素為ECOG評分、既往化療方案數(shù)和EGFR基因突變。提示了雖然吉非替尼可以用于ECOG評分3分-4分的患者和三線甚至更晚使用仍然有效,但是除了EGFR基因突變外,ECOG評分越差和既往的化療方案越多,則吉非替尼治療的PFS越差,患者的獲益越小。特別是ECOG評分與患者生存也相關,提示要在患者一般情況好時就使用吉非替尼,而不是等到患者情況惡化時。
表 6 患者臨床特征對客觀療效的影響Tab 6 The influence of clinical characteristics on objective effects
表 7 不良反應發(fā)生率Tab 7 Rate of adverse events
本研究中EGFR基因突變患者的客觀有效率為43.3%,高于EGFR基因野生型的患者(21.6%)。多篇文獻報道對于最初EGFR基因突變陽性的人群,EGFR-TKIs作為二/三線治療和一線治療的客觀有效率是有差異的,分別為30%-40%[6-10]和70%[5,11,12],這與本研究中EGFR基因突變患者的客觀有效率為43.3%是一致的?;熀驟GFR基因突變患者EGFR-TKI療效下降的原因不清楚。韓如冰等[3]報道化療前后外周血EGFR基因突變狀態(tài)一致率僅為54.5%(18/33),部分患者化療前EGFR基因突變陰性變?yōu)殛栃?,部分患者化療前陽性變?yōu)殛幮?。Chin等[13]將含有EGFR外顯子19缺失突變的NSCLC細胞系PC9細胞系經(jīng)過鉑類化療藥物處理耐藥后,再使用厄洛替尼,發(fā)現(xiàn)厄洛替尼的敏感性降低,說明化療可能在酪氨酸激酶激活通路上亦有作用。因此二/三線EGFR-TKIs治療有效率的降低可能部分歸因于由于化療導致的EGFR-TKIs耐藥,具體機制有待進一步臨床研究證實。
近90%的EGFR基因突變集中于外顯子19的缺失突變和外顯子21點突變,本研究顯示兩種突變的PFS和OS均無差別。在IPASS試驗[5]中,接受吉非替尼的EGFR基因外顯子19缺失突變患者和外顯子21點突變患者分別為66例和64例,兩種突變患者的PFS均大約為9個月。NEJ002試驗[11]中,接受吉非替尼的EGFR基因外顯子19缺失突變患者和21外顯子點突變患者分別為58例和49例,兩種突變患者的PFS分別為11.5個月和10.8個月。上述兩試驗與本研究相似,提示突變類型與治療效果無明顯關系。EGFR基因外顯子19缺失突變和外顯子21點突變的客觀有效率也無明顯差別。
由于本研究是一項回顧性研究,結果也可能存在著一些偏倚。綜上所述,晚期非鱗癌NSCLC EGFR基因突變患者的PFS明顯優(yōu)于野生型患者,OS有延長趨勢。EGFR基因不同突變類型的PFS和OS均無差別。