雞病原腸桿菌的鑒定

房 海，陳翠珍，史秋梅，張艷英，馬增軍，張東林

（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066004）

在腸桿菌屬（Enterobacter）細(xì)菌中，目前研究較多的主要有陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）及產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），已被確認(rèn)可以導(dǎo)致條件性致病，引起呼吸道、泌尿生殖道感染，亦可引起菌血癥等。本研究對分離于發(fā)病死亡雞的11株腸桿菌，進(jìn)行了表觀性狀及系統(tǒng)發(fā)育研究，旨在對雞源腸桿菌的有效檢驗(yàn)與防制等提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)菌分離 采集河北2個(gè)養(yǎng)雞場2004年6月～2005年6月間商品產(chǎn)蛋發(fā)病雞的病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離，根據(jù)采集養(yǎng)殖場不同分為1組和2組。根據(jù)病變特征，分別取病死雞的肝組織為材料，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，分別選取純一或優(yōu)勢生長的菌落移接于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2 細(xì)菌主要表觀性狀檢驗(yàn)

1.2.1 形態(tài)特征檢查取純培養(yǎng)菌制備涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭染色后鏡檢。選擇代表菌株做磷鎢酸負(fù)染色標(biāo)本，置透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.2 主要理化性狀測定取純培養(yǎng)菌分別接種于細(xì)菌理化特性鑒定用培養(yǎng)基，按常規(guī)進(jìn)行氧化酶、接觸酶、糖（醇及苷）類代謝、有機(jī)酸鹽利用等的理化特性測定[1-4]。

1.2.3 致病作用檢驗(yàn)取從兩組分離的代表菌株，分別接種于普通營養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)18 h調(diào)成9×108cfu/mL作為供試菌液，經(jīng)肌肉0.1 ML/只接種健康雛雞，每個(gè)菌株接種5只，同時(shí)設(shè)立同劑量、同批無菌營養(yǎng)肉湯接種的對照5只，隔離飼養(yǎng)；每天觀察其感染后的發(fā)病與死亡情況，以復(fù)制出與自然病例癥狀相同并能重新分離到原感染菌作為相應(yīng)病原菌的判定指標(biāo)。

1.2.4 藥物敏感性測定取兩組分離菌株，采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B）進(jìn)行抗菌類藥物的敏感性測定，以出現(xiàn)抑菌圈直徑作為相應(yīng)的敏感與耐藥判定指標(biāo)[5]。

1.3 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析取不同組分離的代表菌株各1個(gè)，用小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（TaKaRa產(chǎn)品）提取DNA進(jìn)行PCR，PCR引物分別為27F：5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3'、 1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，由上海博亞生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測定。分別對供試菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對，并使用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行序列同源性分析。

1.4 菌種歸類判定 根據(jù)對細(xì)菌形態(tài)、理化特性的檢驗(yàn)結(jié)果，參考文獻(xiàn)[2]和[3]及有關(guān)資料，并結(jié)合16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的結(jié)果，進(jìn)行供試菌的種屬判定。

2 結(jié)果

2.1 自然病例與病變組織中的細(xì)菌分離 對腸桿菌感染雞病例進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)病雞均表現(xiàn)具有腸桿菌感染的敗血癥、腹瀉等特征癥狀。在病死雞的病變組織中，均分離到革蘭染色陰性、中等大小的桿菌。

2.2 分離細(xì)菌與純培養(yǎng) 對1組的3只雞、2組的4只雞肝組織做細(xì)菌分離，結(jié)果1組均分離得到純一的同種細(xì)菌菌落、2組分離到兩種細(xì)菌的菌落（A和B）。隨機(jī)取每只雞的分離菌落做純培養(yǎng)，按分離地、分離日期編號，保存供鑒定用。依次為1組的每只雞1株共3株，編號為HQ040619-1至HQ040619-3；2組的每只雞2株（A和B各1株）共8株，即A菌4株，編號為HC050612-1、HC050612-3、HC050612-5、HC050612-7，B菌 4株，編號為HC050612-2、HC050612-4、HC050612-6、HC050612-8。

2.3 分離菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)特征上述11株純培養(yǎng)菌均為革蘭染色陰性、兩端鈍圓、散在或個(gè)別成雙排列、無芽孢的桿菌，1組的3株大小為0.6μm～0.8μm×1.0μm～1.3μm，2組的8株其中一種大小為0.5μm～0.8μm×1.2μm～2.0μm、另一種為0.5μm～0.8μm×1.0～1.3μm。透射電鏡觀察顯示菌體桿狀、表面似皺褶狀、有微泡，1組的HQ040619-1株周生鞭毛和菌毛（圖1），2組的HC050612-1株（A菌）周生鞭毛（圖2）、HC050612-2（B菌）周生鞭毛和菌毛。

2.3.2 理化特性11株分離菌均為陽性反應(yīng)結(jié)果的項(xiàng)目包括37℃生長、接觸酶、O-F試驗(yàn)（F）、葡萄糖產(chǎn)酸、鼠李糖、乳糖、纖維二糖、甘露醇、麥芽糖、棉子糖、果糖、ONPG、硝酸鹽還原、V-P試驗(yàn)、動(dòng)力（半固體）、蔗糖、甘露糖、赤蘚醇、丙二酸鹽利用、醋酸鹽利用、枸櫞酸鹽利用、海藻糖，在0%、1%及6%NaCl肉湯中生長；均為陰性反應(yīng)結(jié)果的項(xiàng)目包括氧化酶、卵磷脂酶、苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶、DNA酶，明膠液化、吲哚、甲基紅試驗(yàn)、苦杏仁苷、側(cè)金盞花醇、肌醇、衛(wèi)茅醇、糊精、菊糖；反應(yīng)結(jié)果不一致的項(xiàng)目如表1所示。

圖1 顯示周生鞭毛和菌毛（×20 000）Fig.1 Peritrichous flagella and pilus（×20 000）

圖2 顯示周生鞭毛（×20 000）Fig.2 Peritrichous flagella（×20 000）

表1 反應(yīng)不一致的項(xiàng)目及結(jié)果Table 1 Different reactions to the tests among the isolates

2.3.3 人工感染試驗(yàn)的致病作用用HQ040619-1、HC050612-1及HC050612-2株分別感染的健康雛雞，于感染后96 h全部死亡，剖檢可見同自然病例相同的的肝臟腫脹且出現(xiàn)小壞死點(diǎn)、腸道出血等明顯病變。對照組雛雞，觀察10 d均正常存活。對各菌株感染死亡雞，均經(jīng)剖檢后各取2只的肝臟病變組織做抹片經(jīng)革蘭染色鏡檢細(xì)菌及細(xì)菌分離，結(jié)果均能發(fā)現(xiàn)和分離到大量原感染菌。

2.3.4 藥物敏感性各菌株對多數(shù)頭孢類、氨基糖苷類、喹諾酮類、硝基呋喃類等藥物敏感；對青霉素類、多肽類的多種藥物耐藥；對紅霉素、多西霉素及頭孢類的某些種敏感與耐藥在菌株間有差異。

2.4 16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育 將HQ040619-1、HC050612-1及HC050612-4株作為代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序（GenBank登錄號分別為EU0703021，EU047701，EU047702）與系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，HQ040619-1分離株的16S rRNA基因序列長度為1 421 bp；HC050612-1株為 1 449 bp；HC050612-4株為1 451 bp。這3個(gè)菌株的16S rRNA基因序列在NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果均與腸桿菌屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列自然聚類。在檢索出的腸桿菌屬序列中，該菌與它們的同源性均在98%～99%。選取了其中部分菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

圖3 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.5 細(xì)菌種類判定結(jié)果 根據(jù)上述所測相應(yīng)表觀性狀及代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果，判定被檢菌為腸桿菌屬細(xì)菌。其中分離于1組的3株（HQ040619-1～HQ040619-3）和 2組的 A菌 4株（HC050612-1、HC050612-3、HC050612-5、HC050612-7）為陰溝腸桿菌；2組的B菌4株（HC050612-2、HC050612-4、HC050612-6、HC050612-8）為產(chǎn)氣腸桿菌。

3 討論

產(chǎn)氣腸桿菌已作為具有動(dòng)力的種轉(zhuǎn)入克雷伯菌屬，其名為運(yùn)動(dòng)克雷伯菌（K.mobilis），在該屬細(xì)菌中陰溝腸桿菌是一種臨床出現(xiàn)頻率最高的病原菌，已成為一種重要的醫(yī)源性病原菌，另外則是產(chǎn)氣腸桿菌。

國內(nèi)外在人類病例分離到本研究涉及桿菌的報(bào)道已有多篇[7-13]，發(fā)現(xiàn)該菌參與多種人類疾病。在動(dòng)物的陰溝腸桿菌及產(chǎn)氣腸桿菌感染方面目前資料報(bào)道較少[14-16]。本研究對2組雞的腸桿菌感染病例的檢驗(yàn)，表明1組為由陰溝腸桿菌的單獨(dú)感染，另1組為由產(chǎn)氣腸桿菌和陰溝腸桿菌的混合感染所致。病雞缺乏明顯癥狀及剖檢病變特征，病死雞剖檢僅見肝臟、脾臟不同程度的腫脹。通過應(yīng)用分離鑒定的代表菌株對健康雞進(jìn)行的人工感染試驗(yàn)，結(jié)果不僅能復(fù)制出同自然病例的敗血癥感染發(fā)病與死亡，且能重新分離回收到原感染菌，表明所分離鑒定的細(xì)菌為被檢雞的相應(yīng)致病菌，提示在雞的病原菌檢驗(yàn)中應(yīng)予以注意。

藥敏測定結(jié)果顯示兩種菌對所試藥物無株間明顯差異，該結(jié)果可為對腸桿菌耐藥譜及耐藥規(guī)律、選擇用藥防治等提供一定的參考。考慮到本次所檢菌株在區(qū)域分布、菌株數(shù)量等方面的局限性，要明確認(rèn)定該菌的耐藥規(guī)律等還需進(jìn)行不同區(qū)域、不同發(fā)病雞群等大量分離株的檢驗(yàn)，同時(shí)用藥時(shí)最好是對分離菌做藥敏測定以保證最佳治療效果。

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