共表達雞IL-6和H5亞型禽流感病毒HA基因重組雞痘病毒的遺傳穩(wěn)定性研究

陳素娟，丁彥紅，錢 程，柴 茂，彭大新，劉秀梵

（揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室/禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，江蘇揚州 225009）

雞痘病毒載體表達外源基因已發(fā)展到相當(dāng)成熟的程度，但現(xiàn)有的重組雞痘病毒疫苗存在著易受母源抗體干擾、免疫效果不如滅活疫苗的問題，以細(xì)胞因子作為免疫佐劑可能是增加疫苗保護效力的有效途徑之一[1-5]。基于本原理，前期研究構(gòu)建了共表達雞IL-6基因和H5亞型禽流感病毒（AIV）HA基因重組雞痘病毒。

將外源基因插入雞痘病毒之后，經(jīng)過細(xì)胞傳代，能否完整的、穩(wěn)定的表達插入的外源基因是評價一種能夠運用于實際生產(chǎn)的重組基因工程疫苗穩(wěn)定性和疫苗免疫原性的重要依據(jù)[6]。

本研究通過檢測重組病毒傳代后的增殖特性、外源基因的穩(wěn)定性及基因表達等方面評價該重組雞痘病毒的遺傳穩(wěn)定性，為重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩(wěn)定性和該疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒與細(xì)胞 野生型雞痘病毒疫苗株（w t-FPV）由本室保存；表達H5亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒rFPV-AIH5A由本實驗室構(gòu)建[7]；共表達雞IL-6和H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒（rFPV-AIH5AIL6）及單表達雞IL-6基因的重組雞痘病毒（rFPV-IL6）由云水麗等構(gòu)建[1]。SPF雞胚購自山東家禽所SPF場。

1.2 主要試劑 High Pure PCR Template Preparation Kit、Agarose Gel DNA Extraction Kit購自 AXYGEN公司；細(xì)胞用培養(yǎng)基F10、M 199及FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG購自Sigma公司。

1.3 生長曲線及蝕斑直徑的測定 rFPV-AIH5AIL6及對照組病毒rFPV-AIH5A、rFPV-IL6和 w t-FPV以105PFU分別感染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h收獲病毒，反復(fù)凍融3次，進行蝕斑計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果計算病毒原液中含有的PFU，繪制生長曲線。同時每孔隨機選取典型單個存在的蝕斑，在顯微鏡下用卡尺測量蝕斑直徑。

1.4 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性測定 rFPV-AIH5AIL6在SPF CEF中增殖，待細(xì)胞病變（CPE）達80%左右時收獲，連續(xù)傳代至20代。

1.4.1 傳代病毒HA基因及雞IL-6基因的PCR檢測和序列測定根據(jù)文獻[1]和[8]分別設(shè)計擴增HA基因和IL-6基因的引物。PHA-1：5'-GGATCCGCCACC ATGGGAAAATAGTGCTCTTTCTT-3'， PHA-2： 5'-G TCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAG GGTG-3'； PIL6-1： 5'-ATGAACTTCACCGAGGG-3'，PIL6-2：5'-TCAGGCACTGAAACTCCT-3'。

將重組病毒接種原代CEF培養(yǎng)，CPE至80%時收獲，按照DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，然后用H5亞型AIV HA基因（1 700 bp）及雞IL-6基因（800 bp）的引物進行PCR。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.4.2 重組病毒HA及雞IL-6表達的測定

1.4.2.1 間接免疫熒光檢測（IFA）：將重組病毒和w t-FPV分別以一定量感染CEF單層，37℃、5%CO2培養(yǎng)至出現(xiàn)典型的空斑時，經(jīng)冷甲醇固定，以雞抗H5 AIV多抗為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG為二抗進行IFA檢測[1]。

1.4.2.2 RT-PCR檢測：以各代次的重組雞痘病毒和w t-FPV分別以一定量感染單層CEF。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)CPE至80%時，按常規(guī)方法提取細(xì)胞總 RNA，RT-PCR方法擴增 IL-6 mRNA。PCR反應(yīng)所用的引物和條件參照文獻[8]，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 重組雞痘病毒的純度檢驗 將0代、5代、10代、20代rFPV-AIH5AIL6分別稀釋至10-3和10-4倍，分別接種于單層CEF中，培養(yǎng)72 h后，出現(xiàn)蝕斑后棄去維持液，用含有200μg/mL X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，培養(yǎng)72 h，觀察染色后藍色蝕斑的百分比，確定重組病毒的純度。

2 結(jié)果

2.1 生長曲線測定的結(jié)果 重組病毒接種單層細(xì)胞以后進行蝕斑計數(shù)，繪制各自的生長曲線，結(jié)果顯示，rFPV-AIH5AIL6與 rFPV-AIH5A、rFPV-IL6及w t-FPV 4種病毒的生長曲線一致，無明顯差異（圖1）。

2.2 蝕斑直徑測定結(jié)果 重組病毒接種單層細(xì)胞，培養(yǎng)72 h以后，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔選取單獨存在的典型蝕斑，測量蝕斑的長與寬，結(jié)果顯示rFPV-AIH5A與 rFPV-IL6、rFPV-AIH5AIL6和 w t-FPV接種CEF形成蝕斑大小無明顯差異（表1）。

2.3 重組雞痘病毒遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.3.1 PCR反應(yīng)及電泳鑒定結(jié)果將0代、5代、10代、20代4個代次的重組雞痘病毒的核酸作為模板進行PCR反應(yīng)均擴增出約1 700 bp和800 bp左右的條帶，分別與HA和IL-6基因片段長度一致（圖 2、圖 3）。

圖1 重組雞痘病毒在CEF生長曲線Fig.1 growth curve of recombinant fow lpox virus in CEF

表1 重組雞痘病毒蝕斑直徑Table 1 Diameters of plaque on CEF formed by recombinant fow lpox viruses

2.3.2 測序結(jié)果將4個代次的重組雞痘病毒的外源基因經(jīng)測序比較后顯示，經(jīng)過20代的傳代，第5代、10代、20代rFPV-AIH5AIL6中HA基因與第0代重組病毒中HA基因序列完全一致，沒有發(fā)生基因突變；而rFPV-AIH5AIL6第20代重組病毒IL-6基因發(fā)生1個點突變（T739A），突變的核苷酸編碼的氨基酸也發(fā)生了相應(yīng)的變化，由于該位點位于終止密碼子，使原有的終止密碼子后移了3個氨基酸，但不影響該蛋白活性功能區(qū)。

2.3.3 重組雞痘病毒中HA基因和IL-6的表達IFA檢測顯示所有檢測代次病毒蝕斑均呈現(xiàn)黃綠色特異性熒光，而對照組則無（圖4），表明各代次重組病毒HA基因的穩(wěn)定表達。

重組病毒感染CEF，形成典型病毒后以細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA，用引物進行PCR擴增，未擴增出條帶；用引物進行RT-PCR擴增，均可擴增出約270 bp左右的IL-6基因（圖5），與預(yù)期大小相符，表明重組雞痘病毒能穩(wěn)定的表達IL-6基因。

2.4 重組病毒的純度檢驗 用各代rFPV感染CEF后，進行藍白斑檢測。當(dāng)重組病毒在CEF上形成蝕斑后，用含有200μg/mL X-gal的營養(yǎng)瓊脂進行覆蓋后，顯示所有病毒蝕斑均呈藍色，以上結(jié)果表明重組病毒基因組內(nèi)的LacZ基因、HA基因及IL-6基因均能夠穩(wěn)定遺傳和表達。

3 討論

在體外，通過蝕斑直徑測定并比較重組病毒的生長曲線，結(jié)果顯示rFPV-AIH5AIL6與rFPV-AIH5A、rFPV-IL6和w t-FPV 4種病毒的生長速度及蝕斑大小是一致的，無明顯差異，表明共表達IL-6基因和AIV HA基因后不影響重組雞痘病毒復(fù)制。

疫苗制備的關(guān)鍵問題是疫苗株的穩(wěn)定性，重組病毒的遺傳穩(wěn)定性受到多種因素的影響，涉及到插入載體非必需區(qū)的篩選，重組后病毒基因組構(gòu)象，外源基因表達產(chǎn)物對病毒的影響等[9-10]。因此，必須經(jīng)過嚴(yán)格的病毒純化和遺傳穩(wěn)定性的檢測[11-12]。張體銀等對20代重組雞痘病毒細(xì)胞毒的遺傳穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，插入基因的所有堿基和氨基酸序列均與原始轉(zhuǎn)移載體序列一致，傳代后重組病毒的免疫原性未發(fā)生改變[13]。喬傳玲等對25代重組雞痘病毒rFPV-AIH5ANA的遺傳穩(wěn)定性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與克隆得到的基因相比，各代重組病毒中HA基因均有2個位點發(fā)生A492G、T1560C替換突變，認(rèn)為這是重組病毒為保持自身的穩(wěn)定而使得外源基因發(fā)生了一定的改變，以使G+C含量提高[14]。本研究中也對我們構(gòu)建的重組病毒進行了遺傳穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)rFPV-AIH5AIL6在CEF細(xì)胞上傳20代后，進行PCR擴增并測序后發(fā)現(xiàn)HA基因序列無任何堿基、氨基酸的變化，與原始序列完全一致；進行藍白斑檢測和IFA鑒定，顯示感染重組病毒的CEF蝕斑100%為藍斑，感染重組病毒的CEF蝕斑均有特異性熒光，證明了HA基因在重組雞痘病毒中的穩(wěn)定表達，沒有發(fā)生自然丟失。針對重組病毒中的IL-6基因，RT-PCR檢測結(jié)果表明重組病毒中IL-6基因可以穩(wěn)定表達。IL-6基因終止密碼有一氨基酸發(fā)生變異，但其沒影響到其抗原表位，表明具有良好的遺傳穩(wěn)定性。為該疫苗的進一步研究提供了保障。

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