抗ICAM-1單克隆抗體的生物學(xué)功能研究

李月紅，孟銳奇，朱 平，陳 萍，趙福廣，張培軍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春 130118；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；3.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗(yàn)中心，吉林長春 130062）

細(xì)胞間粘附分子 1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）存在于細(xì)胞膜表面，屬于免疫球蛋白超家族的成員。參與粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，在炎癥發(fā)生過程中起促進(jìn)作用；與T細(xì)胞黏附參與抗原遞呈，在細(xì)胞免疫應(yīng)答中起增強(qiáng)效應(yīng)[1]。

白細(xì)胞的滲出是炎癥反應(yīng)最重要的特征。白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)游出和趨化作用到達(dá)炎癥灶[2]。其中粘附作用是內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面粘附分子相互識別引起的。炎癥可使內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表達(dá)過量的ICAM-1[3]，目的是增強(qiáng)彼此的親合性。同時，ICAM-1表達(dá)的異常能加劇多種疾病發(fā)生和發(fā)展[4]。趙宏霞等研究證明了ICAM-1及其受體在高致病性禽流感病毒性肺炎中數(shù)量明顯增加[5]。阻遏ICAM-1可以抑制某些病理性損傷。因此，我們制備了抗ICAM-1單克隆抗體（MAb），以單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用模型和小鼠炎癥模型，評價(jià)所制備的MAb阻斷ICAM-1及抑制炎癥反應(yīng)的功能。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與細(xì)胞系 抗ICAM-1MAb 4F1和2C5由本室制備[6]；人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304由本室保存；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（FITC-IgG）購自華美生物工程有限公司；IL-1購自鼎國公司；乳酸脫氫酶（LDH）定量檢測試劑盒購自GENMED SCIENTIFICS公司。實(shí)驗(yàn)動物均選用清潔級健康昆明小鼠，體質(zhì)量為18 g～20 g，購于長春生物制品所；人血來自長春醫(yī)院健康自愿者。

1.2 MAb親和力測定 采用非競爭酶免疫試驗(yàn)。純化的每株MAb，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其起始濃度，以不同抗原濃度進(jìn)行抗體倍比稀釋的間接ELISA檢測，繪制反應(yīng)曲線，以曲線上最大OD490nm值一半時的抗體濃度計(jì)算MAb的親和力常數(shù)，確定抗體與抗原的結(jié)合能力?？贵w親和力常數(shù)以如下公式計(jì)算。

[Ab']：表示抗原濃度為[Ag']時OD=1/2ODmax對應(yīng)抗體濃度；

[Ab]t：表示抗原濃度為[Ag]t時OD=1/2ODmax對應(yīng)抗體濃度；

n：為抗原[Ag']與[Ag]t間的稀釋倍數(shù)。

1.3 間接免疫熒光（IFA）檢測細(xì)胞結(jié)合活性 用10%FCS-RPM 11640完全培養(yǎng)基將人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞懸起，加入IL-1，在37℃、5%CO2中培養(yǎng)24 h。按1×106/mL細(xì)胞數(shù)在蓋玻片上過夜培養(yǎng)后，加入100%的冰丙酮固定15m in，用3%BSA封閉2 h；以封閉緩沖液稀釋的抗ICAM-1MAb為一抗，以羊抗鼠FITC-1gG為二抗，緩沖液洗滌后，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 外周血單核細(xì)胞（PBMC）分離 人靜脈抗凝血血，用pH7.2的Hank's液將抗凝血稀釋1倍，混勻；取淋巴細(xì)胞分離液加入離心管中，分離液與稀釋血液比例為1∶1；水平離心1 700 r/min～2 000 r/min，15 min；用毛細(xì)吸管直接伸到淋巴細(xì)胞層（即淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞層，為試管中一層白膜環(huán)），將細(xì)胞吸出，加入一定量（約1∶5的體積比）的pH7.2的Hank's液，混勻，離心，棄去上清（洗去血小板、分層液和血漿），將殘留紅細(xì)胞以8.77%氯化銨裂解處理后進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附率測定 將內(nèi)皮細(xì)胞ECV304單層用D-Hanks液洗2次后，加ICAM-1 MAb。每孔加單核細(xì)胞懸液100μL（1×105cell/well），置37℃5%CO2孵育，用預(yù)溫的MEM培養(yǎng)液輕輕洗去未粘附單核細(xì)胞，加0.4%EDTA/PBS 37℃下孵育20 min，解離去粘附的單核細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)測定試劑盒的說明書進(jìn)行，即以乳酸脫氫酶釋放法檢測黏附細(xì)胞總數(shù)，在酶聯(lián)檢測儀中檢測OD490nm值。

黏附抑制率=（對照組黏附細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組黏附細(xì)胞OD值）/對照組黏附細(xì)胞OD值

1.6 ICAM-1 MAb對炎癥毛細(xì)血管通透性的影響

1.6.1 耳廓腫脹試驗(yàn)[7]取小鼠40只，稱量體質(zhì)量，隨機(jī)分為4組。組1各鼠腹腔注射等容積生理鹽水，組2腹腔注射氫化可的松60 mg/kg，組3靜脈注射ICAM-1 MAb 4F1，組4靜脈注射MAb 2C5。1 h后各組小鼠通過尾靜脈注射伊文氏藍(lán)20 mg/kg，將二甲苯0.05m L滴于小鼠右耳（左耳不做處理作為對照），記錄滴二甲苯的時間。觀察各鼠耳殼的顏色變化，記錄耳殼藍(lán)染的出現(xiàn)時間及藍(lán)染深度。2 h后迫殺小鼠，沿耳廓基部剪下雙耳，用直徑1.5 cm的打孔器分別在左、右耳的同一部位打下圓形耳片，稱重，計(jì)算同一小鼠左右耳片重量之差，作為腫脹度。然后分別匯集4個組的結(jié)果，比較組間差異的顯著性。

1.6.2 毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)[8]取小鼠40只，均勻分為4組。各組分別注射生理鹽水、氫化可的松、ICAM-1 MAb 4F1及2C5，劑量同上。在小鼠左側(cè)腹部涂抹8%的硫化鈉溶液脫毛，于給藥1 h后，各組小鼠分別于尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)溶液（0.01m L/g），同時在脫毛皮膚表面涂抹二甲苯。30m in后迫殺小鼠，將腹部著色皮膚用1.5 cm打孔器取樣，剪碎，置于丙酮（5 ML）∶生理鹽水為7∶3的混合溶液中浸泡24 h。以2 000 r/m in離心10 min，取上清液用紫外分光光度計(jì)測定OD590nm值，計(jì)算伊文思藍(lán)的滲出量。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 MAb的親和力檢測結(jié)果 將純化的4F1和2C5 MAb分別與20、40和80倍稀釋的抗原進(jìn)行非競爭酶免疫試驗(yàn)，繪制ELISA反應(yīng)曲線圖，以圖中曲線上最大OD490nm值一半時抗體的濃度計(jì)算各MAb的親和力常數(shù)，結(jié)果表明4F1的親和常數(shù)為3.86×108L/mol，2C5的親和常數(shù)為 1.75×107L/mol，2株MAb的親和力為4F1>2C5。2株MAb的非競爭ELISA反應(yīng)曲線見圖1和圖2。

圖1 4F1 MAb親合力的ELISA檢測Fig.1 Affinity assay of 4F1 MAb by ELISA

圖2 2C5 MAb親合力的ELISA檢測Fig.2 A ffinity assay of 4F1 MAb by ELISA

2.2 IFA檢測細(xì)胞結(jié)合活性 將人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞培養(yǎng)、固定后，分別加入ICAM-1 MAb 4F1和MAb 2C5進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果顯示，ICAM-1 MAb與人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞中的ICAM-1結(jié)合，呈現(xiàn)出綠色熒光。表明MAb具有與ECV304細(xì)胞結(jié)合活性。圖3結(jié)果顯示，MAb 2C5呈現(xiàn)出綠色熒光強(qiáng)度弱，表明MAb 2C5與ECV304細(xì)胞結(jié)合活性低于4F1。

圖3 ICAM-1MAb與細(xì)胞結(jié)合活性測定Fig.3 Identification of cellular binding activity of MAbs

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附率測定 表1結(jié)果顯示，ICAM-1 MAb具有抑制單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，并且ICAM-1 MAb 4F1對細(xì)胞黏附的抑制作用要優(yōu)于2C5。MAb 4F1使細(xì)胞黏附降低了34.4%，2C5使細(xì)胞黏附降低了26.9%，其差異具有統(tǒng)計(jì)意義（p<0.05）。

表1 內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞粘附測定（OD490nm）Table 1 Identification of cellular adhesive of ECV304 and PBMCs

2.4 小鼠耳廓腫脹試驗(yàn) 用同一小鼠左右耳片重量之差，作為腫脹度。來觀察ICAM-1MAb對二甲苯所致小鼠耳殼水腫及毛細(xì)血管滲透的影響。比較4組試驗(yàn)結(jié)果，組間差異的顯著（p<0.05）。MAb對炎癥毛細(xì)血管通透性具有抑制作用。腫脹度較小，平均值為0.0097 mg和0.0105 mg。但抑制效果低于氫化可的松激素組。腫脹度最小平均值為0.0076 mg對照組腫脹度最大，平均值為0.0134mg（表2）。

表2 小鼠處理組與未處理組耳片重量差異Table 2 Themouse earweight difference of treated and untreated ear

2.5 對二甲苯所致小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性的影響表3結(jié)果顯示，與空白組比較，激素組和MAb組的伊文思藍(lán)滲出量均顯著降低；與2C5組比較，4F1組伊文思藍(lán)滲出量降低明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（p<0.05）。

表3 不同藥物對二甲苯所致小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性的影響Table 3 Effect on themouse capillary permeability w ith difference treatment（μg）

3 討論

細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)數(shù)量的調(diào)節(jié)方式主要有誘導(dǎo)貯存在細(xì)胞內(nèi)的粘附分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面和誘導(dǎo)粘附分子的重新合成兩種方式。轉(zhuǎn)移形式的過程發(fā)生迅速，只需數(shù)秒鐘，但維持時間短暫。如CD11b/CD18、CD11c/CD18貯存在中性粒細(xì)胞的胞漿顆粒內(nèi)，在PMA、TNF、IL-1刺激后迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面[9]。重新合成過程發(fā)生較為遲緩，一般需數(shù)小時，但維持時間較長。IL-1、TNF-α作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞則可以誘導(dǎo)E-selectin、ICAM-1分子的重新合成與表達(dá)，誘導(dǎo)后4 h達(dá)到高峰，并可維持24 h以上。在IL-1和其它一些炎癥介質(zhì)的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞可增加細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)。高表達(dá)ICAM-1促進(jìn)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的粘著。本實(shí)驗(yàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中添加了IL-1，用以刺激內(nèi)皮細(xì)胞大量分泌ICAM-1。本研究證明了ICAM-1 MAb能夠阻斷白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互粘附，減輕炎癥反應(yīng)，為炎癥的治療和診斷奠定了基礎(chǔ)

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