藍舌病病毒重組VP7蛋白單克隆抗體制備及競爭ELISA檢測方法的建立

耿宏偉，秦永麗，李俊平，楊 濤，孫恩成，劉霓紅，白安斌，徐青元，王凌鳳，趙 晶，覃紹敏，林 俊，郭怡璠，吳東來1,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086；4.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；5.廣西大學(xué)，廣西南寧 530004）

藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV），屬呼腸孤病毒科、環(huán)狀病毒屬、藍舌病病毒亞群（Bluetingue virus subgroup），BTV引起的藍舌?。˙T）是由蟲媒傳播的非接觸性反芻動物急性傳染病，尤其對純種細毛羊敏感，死亡率高達35%[1-2]，OIE將其列為實時通報疫病，我國將其規(guī)定為一類動物傳染病[3]。該病分布范圍不斷擴大，危害也日趨嚴重[4-7]。我國于1979年發(fā)現(xiàn)該病存在，現(xiàn)已從全國29省檢出BTV血清陽性家畜。

BTV基因組約19 Kb，由10個節(jié)段的雙股RNA組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP7）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白[8-9]。VP7蛋白由S7基因編碼，是BTV群特異性抗原蛋白，由349個氨基酸組成，約占核心蛋白總量的36%。VP7蛋白位于病毒核衣殼的表面，研究表明，各血清型BTV VP7蛋白94%以上的氨基酸保守，其氨基酸序列的相對保守性決定了VP7是群特異性抗原這一特征[10-14]。

BT的診斷方法多種，免疫熒光試驗和病毒中和試驗需對病毒進行分離培養(yǎng)，操作過程繁瑣，并且存在容易散毒等生物安全問題；熒光定量PCR方法成本較高。進口的抗體檢測ELISA試劑盒價格昂貴，很難在檢測臨床樣品上普及應(yīng)用。因此，本研究應(yīng)用原核表達的BTV-12型VP7蛋白制備群特異性單克隆抗體（MAb），建立了檢測BTV抗體的競爭ELISA方法，為BTV提供一種快速、安全、及低成本的檢測手段。

1 材料和方法

1.1 載體、細胞與病毒株 pMAL-c4X載體購自NEB公司；E.coliDH5α感受態(tài)細胞，BHK-21鼠源腎細胞，SP2/0骨髓瘤細胞，BTV 1～24型毒株，茨城病病毒（IBAV），中山病病毒（CV），赤羽病病毒（AKAV），均由本實驗室保存；牛病毒性腹瀉病毒（BVDV），牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）由本所薛飛研究員提供；牛輪狀病毒（BRV），牛呼腸孤病毒（RV），牛腸道病毒（BEV），口蹄疫病毒（FMDV）由本所于力研究員提供。

1.2 實驗動物 BALB/c雌性小鼠由本所實驗動物中心提供。

1.3 標準血清及樣品 15種不同血清型的BTV標準陽性血清、25份BTV陽性山羊血清、25份陰性山羊血清、AKAV陽性血清由本實驗室保存；IBAV、BRV、FMDV陽性血清由本所于力研究員提供；322份山羊血清樣品采自廣西。

1.4 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、LATaqDNA聚合酶均購自TaKaRa公司；pMAL融合蛋白表達與純化試劑盒購自NEB公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；弗氏佐劑、PEG、HAT、HT、8-氮鳥嘌呤（8-AG）、異硫氰熒光素標記的羊抗鼠IgG（FITC-IgG）、辣根過氧化物酶標記的驢抗綿羊IgG（HRP-IgG）、鄰苯二胺（OPD）均購自Sigma公司；HRP標記羊抗鼠IgG（HRP-IgG）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotechnology公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；BTV抗體檢測試劑盒購自于IDEXX公司。

1.5 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中登錄的BTV-12血清型S7基因序列（AY263377）設(shè)計引物，序列為：BTVP7-F：5'-GACGAATTCATGGACACTATCGC-3'（EcoRⅠ）；BTVP7-R：5'-TAAGTCGACTTACACAT AGGCGGC-3'（SalⅠ）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度為1 049 bp。

1.6 BTV-12型病毒VP7蛋白基因擴增與表達 利用TRIzol法從感染BTV-12的BHK-21細胞中提取病毒基因組RNA作為模板，以BTVP7-R引物做為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。并以其為模板，利用上下游引物進行VP7基因片段擴增。將PCR擴增產(chǎn)物及pMAL-c4X進行連接，構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒（pMAL-VP7），表達并純化VP7蛋白，利用SDS-PAGE，western blot及間接ELISA檢測方法對表達的重組VP7蛋白進行鑒定。

1.7 動物免疫及MAb制備 用純化后的重組VP7蛋白免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，用BTV-12病毒作為包被抗原篩選陽性雜交瘤細胞，具體參照文獻[15]方法進行。

1.8 MAb腹水的制備 取8周齡雌性BALB/c小鼠進行MAb腹水制備，具體參照文獻[15]方法進行。

1.9 MAb亞類測定 按照SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類試劑盒說明書進行檢測。

1.10 間接免疫熒光（IFA）鑒定 將 BTV 1～24、IBAV、CV、AKAV、BVDV、IBRV、BRV、BEV、RV和FMDV分別接種于BHK21單層細胞，待出現(xiàn)細胞病變（CPE）時棄上清，加入70%預(yù)冷的無水乙醇，4℃固定30 min。分別以重組VP7蛋白免疫的鼠陽性，陰性血清和MAbs為一抗，以羊抗鼠FITC-IgG為二抗，進行IFA鑒定。

1.11 競爭ELISA（C-ELISA）檢測方法的建立 將重組VP7蛋白用0.05 mol/L（pH9.6）的碳酸鹽緩沖液稀釋為 10μg/mL、5μg/mL、2 μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的濃度，分別包被ELISA板，4℃包被過夜。以5%的脫脂乳PBST作為封閉液，37℃作用1 h。分別加入陰性血清和15種抗不同血清型的BTV陽性血清，37℃作用1 h。用封閉液將MAb做10-1～10-8倍梯度稀釋，采用矩陣法加入到不同抗原濃度包被的ELISA板中，37℃分別作用0.5 h、1 h、1.5 h、2 h。加入 HRP-AntiM-IgG，37℃作用 1 h。在每次更換反應(yīng)液之間，用PBST洗滌3次。加入底物顯色液，37℃避光顯色10 Min，2 MH2SO4終止反應(yīng)后，測定OD492nm值，計算阻斷率，確定具有BTV群特異性阻斷效果的MAb。對建立的C-ELISA主要組成成份進行保存期試驗，驗證其穩(wěn)定性。

1.12 判定標準的確定 利用建立的C-ELISA檢測方法，測定25份BTV陽性山羊血清和25份陰性山羊血清，確定樣品判定標準。

1.13 特異性試驗 利用建立的C-ELISA方法，分別檢測 IBAV、AKAV、BRV、FMDV、BTV-12型病毒陽性血清和陰性血清，測定各血清阻斷率。

1.14 重復(fù)性試驗 采用同批次和不同批次包被的ELISA板對25份BTV陽性山羊血清和25份陰性山羊血清分別檢測3次，比較檢測結(jié)果的變異情況。

1.15 符合性試驗 利用本研究建立的C-ELISA檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒，同時檢測15種抗不同血清型的BTV陽性血清、25份BTV陽性山羊血清和25份陰性山羊血清，計算兩者的符合率。

1.16 臨床樣本檢測試驗 利用本研究建立的C-ELISA檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒，同時檢測采自廣西省的322份現(xiàn)地山羊血清樣品，將檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，評價本研究建立的C-ELISA檢測方法的效果。

2 結(jié)果

2.1 BTV-12型病毒VP7蛋白基因擴增與表達RT-PCR擴增產(chǎn)物約為1 Kb，與預(yù)期大小相符（圖1-A）。重組質(zhì)粒pMAL-VP7經(jīng)酶切鑒定，與預(yù)期大小相符。利用pMAL融合蛋白表達與純化試劑盒對VP7蛋白進行融合表達并純化，SDS-PAGE分析表明VP7蛋白融合表達，其分子質(zhì)量約為90 ku，并以可溶形式存在（圖1-B）；western blot分析表明重組VP7蛋白能夠與HRP標記的抗MBP標簽的MAb反應(yīng)（圖 1-C）。

圖1 VP7基因的RT-PCR擴增及表達鑒定Fig.1 The RT-PCR Amplification of the VP7 gene and analysis of MBP-VP7 expression by SDS-PAGE and western blot

2.2 C-ELISA鑒定重組表達的VP7蛋白的群特異性 用純化的重組VP7蛋白包被ELISA板，與15種抗不同血清型BTV陽性血清，進行間接ELISA反應(yīng)，結(jié)果表明重組VP7蛋白能夠與抗不同血清型BTV陽性血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的群特異性（圖2）。

2.3 雜交瘤細胞間接ELISA篩選條件 以10-7.875TCID50/0.1 ML的BTV-12型病毒為抗原，小鼠陽性和陰性血清為抗體，采用矩陣法確定抗原和抗體均進行1∶100倍稀釋為陽性雜交瘤細胞間接ELISA篩選條件。

2.4 MAb獲得 細胞融合后，經(jīng)3次細胞克隆純化，共獲得2株抗BTV的MAb，分別命名為BTV-2D10和 BTV-4H7。

2.5 MAb腹水效價測定及亞類鑒定結(jié)果 利用BTV-12病毒為抗原的間接ELISA檢測方法進行鑒定，結(jié)果表明BTV-2D10和BTV-4H7 MAb的腹水效價分別為1∶10-6和1∶10-7。利用抗體亞類試劑盒鑒定，結(jié)果表明2株MAb均為IgG1/κ亞型。

2.6 IFA鑒定MAbs特異性 將所獲得的2株MAb腹水進行1∶100倍稀釋后分別與BTV 1～24、IBAV、AKAV、CV、BVDV、IBRV、BRV、BEV、RV及FMDV感染的細胞做IFA鑒定，結(jié)果表明2株MAb均能與BTV 24個血清型病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生較強的特異性免疫熒光，而與IBAV、AKAV、CV、BVDV、IBRV、BRV、BEV、RV及FMDV不反應(yīng)，證明所篩選到的2株MAb均為BTV群特異性MAb。

2.7 C-ELISA檢測方法的建立 通過矩陣法確定，C-ELISA檢測方法中重組VP7蛋白的最佳包被濃度為10μg/mL，MAb的最佳稀釋倍數(shù)為1 000倍、作用時間為37℃ 1 h，待檢血清為原倍血清。利用C-ELISA檢測方法對2株MAb進行篩選，結(jié)果表明BTV-4H7 MAb具有良好的群特異性阻斷效果，對15種抗不同血清型的原倍BTV陽性血清的阻斷率可達71%～84%（圖3）。經(jīng)驗證真空包裝的ELISA反應(yīng)板及BTV-4H7 MAb在保存9個日后反應(yīng)原性無改變。

2.8 判定標準的確定 通過對25份BTV陽性山羊血清和25份陰性山羊血清的檢測，確定本研究建立的C-ELISA檢測方法的判定標準為，阻斷率≤30%為陰性樣品、阻斷率≥40%為陽性樣品、30%<樣品阻斷率<40%為疑似樣品。

2.9 特異性試驗結(jié)果 利用本研究建立的C-ELISA檢測方法對IBAV、AKAV、BRV、FMDV陽性血清進行檢測，結(jié)果表明以上各血清阻斷率均小于30%，判定為陰性，證明本研究建立的檢測方法具有較好的特異性（表1）。

表1 特異性試驗結(jié)果Table 1 The specificity test

2.10 重復(fù)性試驗結(jié)果 利用相同批次和不同批次包被的ELISA板對25份BTV陽性山羊血清和25份陰性山羊血清分別進行3次檢測，結(jié)果基本一致，證明本研究建立的C-ELISA檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.11 符合性試驗結(jié)果 利用本研究建立的C-ELISA檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒，同時檢測15種抗不同血清型BTV陽性血清、25份BTV陽性山羊血清和25份陰性山羊血清，結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果符合率為100%（表 2）。

表2 效果對比試驗Table 2 Contrast test

2.12 臨床樣本檢測試驗 利用本研究建立的C-ELISA檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒，同時檢測采自廣西省的322份山羊血清樣品，結(jié)果表明本研究建立的C-ELISA檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒檢測結(jié)果符合率高達 98%（表 3）。

表3 臨床樣本檢測結(jié)果Table 3 The clinical samples detection

3 討論

BTV血清型眾多，目前已發(fā)現(xiàn)24個血清型，根據(jù)不同的地理位置又分為不同的亞型[16]，世界各國尚未研制出十分有效的BTV疫苗。使用準確的檢測手段加強藍舌病病原學(xué)監(jiān)測工作，及時隔離和捕殺己感動物是減少經(jīng)濟損失的關(guān)鍵。

以群特異性抗原包被ELISA板及具有群特異性阻斷效果的MAb為基礎(chǔ)的競爭ELISA（C-ELISA）檢測待檢樣品中的BTV抗體、以具有群特異性效果的MAb為基礎(chǔ)的雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）檢測待檢樣品中的BTV抗原等免疫學(xué)檢測方法，具有特異、敏感、穩(wěn)定和安全的特點，是近年來廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)[17]。

本研究利用原核表達的重組VP7蛋白作為免疫抗原，利用純化的BTV-12型病毒粒子作為篩選抗原，篩選到1株具有BTV群特異性阻斷效果的MAb，并利用該株MAb建立了C-ELISA檢測方法。符合性試驗結(jié)果表明建立的C-ELISA檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒符合率達100%，臨床樣本檢測試驗表明該檢測方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒符合率達98%。本研究建立的C-ELISA檢測方法，為我國BT流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測提供了快速、安全、低成本的方法，為畜牧業(yè)健康發(fā)展提供了有力保障，具有良好應(yīng)用價值。

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