慢性疲勞綜合征與XMRV關系之爭＊

張擁軍

2011年12月23日，美國《科學》雜志罕見地在未征得當事人同意的情況下，宣布全部撤銷了2009年刊登的一篇文章［1］，至此，這場吸引國際上眾多科學家參與、歷時兩年多的慢性疲勞綜合征與XMRV關系的爭論落下帷幕。本文擬對這一事件的來龍去脈進行綜述，及時澄清可能產生的一些誤導，探討該事件對今后病原生物學研究領域的啟迪。

1 起因——XMRV與慢性疲勞綜合征相關假說的提出

1．1 慢性疲勞綜合征 慢性疲勞綜合征（chr onic fatigue syndrome，CFS）又稱為肌痛性腦脊髓炎（myal gic encephalo myelitis，ME），是一種以慢性疲勞為主要表現的臨床綜合征。主要癥狀包括持續(xù)6個月以上不明原因的持續(xù)性疲勞，活動能力的顯著下降，即使適度休息也不能減輕。出現記憶力下降、睡眠障礙、全身關節(jié)和肌肉疼痛、咽喉酸痛、頭痛、淋巴結觸痛等癥狀，還可能出現其它癥狀如腹痛、惡心、腹瀉、胸痛、對光聲音和氣味敏感、抑郁、易激惹、焦慮等［2－4］。據估計，全球有大約1 700萬不同程度的CFS病例，多為女性，男女比例為1∶6［4］。

關于CFS的致病因子，多年來一直沒有定論。曾經有人提出過CFS產生及癥狀持續(xù)的生物學、遺傳學、感染以及心理學機制，其中候選的感染因子有EB病毒、腸道病毒、細小病毒B19、博爾納病毒、貝氏柯克斯體、肺炎衣原體等，均告失?。?－4］。因此，CFS病例缺乏具有診斷價值的特征性異常指標。

目前CFS研究中，廣泛采用的是1994年美國CDC修訂的診斷標準。在CFS的治療方面，藥物治療的作用十分有限［3］，也不存在特異性治療藥物。

1．2 XMRV 異嗜性鼠白血病病毒相關病毒（xenotr opic murine leukemia vir us－related vir us，XMRV）為單股RNA病毒，屬于逆轉錄病毒科，γ－逆轉錄病毒屬，同屬的還有鼠白血病病毒（MLV）、Friend病毒、貓白血病病毒（FLV）等。XMRV基因組全長約8100個核苷酸，與多種小鼠的內源性逆轉錄病毒同源性達95%，而與部分小鼠外源性病毒相似性為93%～94%［5］。2006年首次發(fā)現XMRV，并認為該病毒感染與前列腺癌存在一定聯系。

1．3 2009年《科學》論文 2009年10月，美國內華達州 Whittemore Peterson研究所（WPI）的 Mikovits實驗室在《科學》雜志發(fā)表《在CFS患者血液細胞中感染性逆轉錄病毒XMRV的檢測》一文，首次宣布了該實驗室的研究成果［1］。他們發(fā)現從101例CFS患者外周單核細胞（PBMCs）中，有68例（67%）檢測到XMRV的gag基因序列，而218名健康對照僅檢出8例（3．7%）。而且，他們的合作實驗室——CCF的Sil ver man實驗室也通過PCR擴增和序列測定證實了11例WPI提供的CFS樣品中，有7例患者的PBMC DNA中檢測到352nt的XMRV env基因片段和736 nt的gag基因片段。同時，他們還采用流式細胞儀和蛋白印跡的方法測定了患者PBMC中XMRV的蛋白表達，并發(fā)現從一名患者PBMC分離的T細胞和B細胞經過活化，能夠感染XMRV。細胞培養(yǎng)也顯示來自患者的XMRV具有感染性，病毒可能通過細胞和無細胞傳播。未感染的原代淋巴細胞及指示細胞系暴露于激活的CFS患者PBMCs、B細胞、T細胞或血漿均可引起繼發(fā)感染。根據以上幾個方面的事實，作者認為XMRV可能是CFS致病的促進因子。

這篇論文在《科學》雜志發(fā)表后，立即受到全世界新聞媒體、病毒學及CFS臨床和研究領域的高度關注。雖然少數學者仍然持懷疑態(tài)度，一些知名學者還是根據文章里提供的數據肯定了這項發(fā)現的重要意義。而2010年8月，美國國立衛(wèi)生研究院（NI H）、食品藥品管理署（FDA）以及哈佛大學的研究人員聯合發(fā)表在美國《國家科學院院刊》的論文，也支持了《科學》論文中類似的觀點［6］。雖然他們檢測到的不是XMRV本身的序列，但他們發(fā)現90年代中期，哈佛大學CFS專家Ant hony Ko mar off收集的37名CFS患者樣品（PBMC和全血）中，有32名（87%）可以檢測到 MLV相關病毒（MLV－related vir us）的gag基因序列，而44名健康對照僅3名（6．8%）陽性。

1．4 影響 這篇論文的問世，迅速在生物醫(yī)學多個領域產生了巨大影響。在CFS研究領域，研究人員正苦于找不到合適的生物致病因子作為診斷指標，因此當務之急是盡快證實該病毒在本地CFS研究人群中的檢出率，以便及時調整研究方向和策略，有針對性地研制相應的治療藥物；對診斷試劑廠商來說，無疑是一個新的商機。盡快研發(fā)特異而穩(wěn)定的診斷試劑，意味著早日占領市場，最初的診斷試劑就一度超過600美元；對血液中心，如果CFS患者XMRV感染率較高，病毒是否會通過輸血傳播，直接關系到輸血安全。因此需要對獻血員進行篩查，并考慮是否應該對CFS患者獻血采取限制措施；而對CFS患者，一旦證實XMRV感染是致病元兇，就可能結束CFS無藥可治的困境，也意味著可以嘗試一些抗逆轉錄藥物治療。為了早日康復，甚至有患者已經迫不及待地開始自行服用這類藥物。

2 質疑——令人失望的XMRV檢出率

然而，《科學》論文刊出后不久，接踵而至的質疑估計作者始料未及。盡管沒有統(tǒng)一的標準試劑，世界各地一直致力于CFS致病因子研究的團隊立即創(chuàng)建了各自的相關檢測體系，重新檢測現有患者樣品中XMRV。令人驚奇的是，得到的檢出率與該文結果大相徑庭。其中，英國倫敦帝國大學的 Mc－Cl ure實驗室［7］率先報告了他們的陰性結果。他們從186名CFS患者血液樣品中提取DNA，用套式PCR的方法檢測可能存在的XMRV前病毒序列，但沒有發(fā)現任何XMRV或MLV相關序列。而后，英國國家醫(yī)學研究所也報告了類似結果［8］。他們檢測了170名CFS患者及395名對照的樣品，用PCR方法未能從299份樣品（患者及健康對照）中檢測到XMRV相關DNA，血清學方法從565份樣品中發(fā)現26份有中和抗體陽性，但只有1份為CFS病例。幾乎同時，荷蘭學者［9］對76名CFS患者及69名對照PBMC，采用實時熒光PCR檢測X MRV整合酶基因及套式PCR檢測gag基因，也沒有檢測到XMRV序列。除了CFS人群，為了確定CFS獻血員或其它人群中是否存在XMRV，保障輸血安全，各國研究人員還對部分獻血員血樣進行了篩查，普遍得到極低的檢出率［10］。因此，隨著一系列陰性結果的出爐，人們逐漸開始懷疑該論文的結果，如此懸殊的檢出率，究竟是XMRV毒株的變異？患者群體的差異（地域、種屬、病例標準）？還是實驗室污染？而面對蜂擁而至的質疑，Mikovits實驗室［11］強調這些陰性結果采用的檢測方法和實驗步驟與他們論文中描述的不完全一致，尤其是樣品DNA不是來自經過活化的PBMC，檢出率會低一些。

3 驗證——多家實驗室參與的聯合調查

為了打消公眾的疑慮，準備平行盲樣、采用敏感性相當的檢測方法、同時在多家實驗室進行檢測得出的結果才最具有說服力。美國CDC［12］采集了51例CFS患者及56名健康人血樣，CDC的實驗室采用蛋白印跡實驗發(fā)現51例CFS及53名對照均為陰性，德國的羅伯特．郭霍研究所（Robert Koch－Instit ute，RKI，為德國聯邦公共衛(wèi)生機構）實驗室采用ELISA方法發(fā)現51例CFS及53名對照各有一例弱陽性；而CDC實驗室還用套式PCR方法檢測病毒gag和env基因，50名CFS患者、56名對照、41名獻血員全部陰性；美國加州一家實驗室也獲得了同樣的PCR結果。這樣的結果顯然不支持XMRV與CFS存在聯系。隨后，NI H組織了9個實驗室（其中包括來自 WPI、NI H、CDC、FDA等機構的實驗室）參與的盲樣測試［13］。他們采集了15名以前報道XMRV／MLV陽性的血樣（其中14例為CFS），以及15名先前報道陰性的健康獻血員，編號，以盲樣分發(fā)給9家實驗室，檢測XMRV／MLV核酸、病毒復制和抗體。結果僅2家實驗室發(fā)現XMRV／MLVs相關證據；盡管所有實驗方法對CFS樣品及陰性對照的敏感性相似，得到的平行樣品結果卻不一致，說明目前血樣中XMRV／MLV的檢測方法重復性較差，不足以用于獻血員篩查。另外，一項規(guī)模更大、由哥倫比亞大學Ian Lipkin實驗室率領的調查仍然在進行中，該項目由NI H下屬的國家過敏及傳染性疾病研究所（NIAID）資助，有WPI、NI H及CDC幾家實驗室參與，測試對象來自150名CFS患者、150名健康對照樣品，患者群體分別來自6個美國臨床機構［14］。

4 證據——假陽性的源頭

但2010年底，陸續(xù)出現一系列不利于Mikovits實驗室的證據，實驗室污染源頭包括樣品制備、試劑及細胞系本身等多個因素［15－19］。

首先，樣品制備過程中可能出現污染，尤其是鼠源DNA污染。對于經常開展小鼠細胞系（如NI H3 T3）及動物實驗的實驗室來說，鼠源DNA無處不在，因此在采血、PBMC分離以及DNA純化步驟，極有可能混入鼠源DNA。最初的質疑多數采用PCR擴增XMRV相關片段的方法（傳統(tǒng)PCR、RTPCR、套式PCR或實時熒光PCR等），因此又暴露出一系列來自PCR試劑的污染源。由于PCR突出的擴增效率，尤其是套式PCR需要對首輪產物進行二次擴增，在提高了檢測靈敏度的同時，也增加了假陽性的風險。美國CDC的實驗室［15］調查發(fā)現，6個廠家的重組逆轉錄酶，無論是來自MLV還是A MV，都存在MLV的pol基因DNA序列，而不是gag基因或小鼠DNA。由于序列分析顯示與Moloney MLV高度相關，推測是存在含RTase基因的質粒污染。而一些商業(yè)化PCR試劑盒中，采用了熱啟動Taq DNA聚合酶，其中關鍵的單克隆抗體，制備過程中可能會帶來痕量小鼠DNA［16］。這些痕量小鼠DNA的存在，很難排除一些小鼠內源性逆轉錄病毒前病毒的污染，因此對先前從CFS患者樣品檢出X MRV／MLV序列的結果高度懷疑。

然而，更加致命的證據是發(fā)現細胞系受到污染。PNAS論文發(fā)表后，英國學者［18］就通過序列分析，發(fā)現前列腺癌細胞系22 Rv1中的X MRV序列是所有CFS患者序列的祖先，PCR檢測到的患者XMRV片段可能是小鼠DNA污染所致，22Rv1細胞系可能在裸鼠體內移植過程中感染了XMRV。隨后，幾家美國實驗室合作［19］，通過對22 Rv1相關的一系列細胞系遺傳背景的研究，發(fā)現最初的人類前列腺癌細胞系CWR22并不存在XMRV。在小鼠體內傳代過程中，前病毒Pre－XMRV1與 Pre－XMRV2發(fā)生重組，現在常用的22Rv1細胞系中的XMRV實際為兩種小鼠內源性逆轉錄病毒重組的產物。而且，通過分析這些前病毒在小鼠基因組染色體位點以及整合位點等資料，發(fā)現Pre－XMRV1主要存在于亞洲小鼠，而Pre－XMRV2存在于歐洲小鼠。沒有任何一個野生小鼠系同時含有這兩種前病毒，僅在3個實驗小鼠品系中同時存在這兩種前病毒［20］。另外，針對PNAS論文中檢測到的相隔15年的CFS患者病毒序列，英國學者同樣通過序列分析［21］，發(fā)現在兩個時間點的患者序列代表的是完全不同的內源性小鼠逆轉錄病毒，顯然不符合逆轉錄病毒在患者體內的進化模式，表明存在污染。

雖然面對質疑，有兩位這篇《科學》論文的作者后來在重復檢測樣品時，發(fā)現部分CFS患者PBMC DNA提取過程中存在XMRV質粒的污染，于2011年10月同意對該文部分撤稿，其余作者仍然不同意全部撤稿。在12月23日《科學》正式撤稿出臺后，12月28日唯一支持該文的PNAS論文也被撤稿。

5 XMRV事件的反思

前后持續(xù)了兩年多的XMRV與CFS關系之爭，為了證明這個假說的真?zhèn)?，牽涉了多個國家眾多研究人員參與。對于病原生物學領域來說，尤其是今后提出任何新的病原體感染與人類疾病的關系，這場爭論值得研究人員反思。首先，需要隨時警惕實驗室污染。這次事件的調查表明，除了偶爾操作不當可能引入污染，一些廠商的PCR試劑（DNA聚合酶和逆轉錄酶）也可能會有痕量的鼠源DNA污染，同時，一些關鍵實驗步驟中新引進的細胞系，必須清楚其來源及傳代背景。其次，不要迷信權威。雖然這次事件的始作俑者是一家不知名的私立實驗室，但在質疑聲中，也有一些知名科學家以及部分FDA、NI H的實驗室參與，甚至輕率地得出了錯誤的結論，使質疑過程拖延了過長時間。再次，今后提出任何新的病原體感染與人類疾病關系的假說，都需要嚴格遵循“郭霍原則”或者“分子郭霍原則”，并進行嚴謹的實驗證明，謹慎得出結論，以免誤導公眾。

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