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    液態(tài)甲醛對雄性小鼠生殖毒性的研究

    2012-08-14 08:01:48李亞琳
    動物醫(yī)學進展 2012年12期
    關(guān)鍵詞:生精染毒睪丸

    李亞琳

    (渭南師范學院化學與生命科學學院,陜西渭南714000)

    甲醛(formaldehyde)是一種無色、有刺激性氣味的 氣體,是重要的化工原料和有機溶劑,廣泛用于制造樹脂、塑料、橡膠、染料和油漆等。由于甲醛揮發(fā)度低,易從家具與裝飾材料中緩慢釋放而污染室內(nèi)空氣,經(jīng)呼吸道進入人體,并對機體健康產(chǎn)生各種危害[1]。室內(nèi)裝修中使用含有污染物的劣質(zhì)建筑裝飾材料,使居民的室內(nèi)空氣也受到了嚴重的污染[2],而且已成為危害公共健康的重要環(huán)境因素之一。甲醛作為一種常見的裝修型化學性室內(nèi)空氣污染物,以其來源廣,污染水平高,持續(xù)時間長,毒性大,毒害作用種類繁多等特點,受到人們的廣泛關(guān)注,世界衛(wèi)生組織(WHO)已將甲醛列為A1類化合物——人類致癌物[3]。甲醛對動物染毒的試驗研究表明,甲醛引起的危害是多方面的,如致雄性小鼠的DNA單鏈斷裂、染色體異常、姐妹染色體交換、基因突變、呼吸道和眼部刺激作用、致敏作用和免疫毒性、遺傳毒性[4-5],并能導致癌癥、肺及肝功能損害、神經(jīng)行為改變等[6-7]。隨著對甲醛的廣泛使用,關(guān)于甲醛污染對人體造成的危害已經(jīng)引起人們的高度重視。

    本試驗將采用液態(tài)甲醛染毒的方法,通過給小鼠腹腔注射不同濃度的甲醛溶液,觀察小鼠行為變化,測定小鼠睪丸的臟器系數(shù)、精子總數(shù)、精子存活率,并通過組織切片觀察生殖系統(tǒng)的病理變化,來探討甲醛對成年雄性小鼠生殖系統(tǒng)的毒性效應,為研究甲醛引起的人類疾病提供一定的試驗資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 成年雄性小鼠,體重為25g±2g,購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心,自由飲水和進食。

    1.1.2 試劑 生理鹽水,福爾馬林溶液,700、800、950mL/L乙醇,無水乙醇,二甲苯,伊紅,蘇木精,蛋白甘油,鹽酸乙醇,切片石蠟,中性樹膠。

    1.1.3 儀器 移液槍,恒溫水浴箱,電子分析天平,切片機,顯微鏡等。

    1.2 方法

    1.2.1 分組 雄性小鼠16只,試驗前先觀察1周,然后隨機分成4組,包括對照組和3個染毒組,每組4只。

    1.2.2 染毒方法 在無菌條件下,用生理鹽水配置成不同濃度的甲醛溶液,其濃度分別為2、20、200 mL/kg,臨用時配制。用不同濃度的甲醛溶液腹腔注射染毒,給藥量為每只小鼠0.1mL,對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。每天上午10:00注射1次,持續(xù)3周,同時觀察行為變化。

    1.2.3 行為的觀察 每日觀察并記錄小鼠的飲食變化,外觀體征,行為活動,糞便性狀。

    1.2.4 睪丸臟器系數(shù)的測定 每組小鼠脫頸椎處死后稱其體重,并迅速取出睪丸,用電子天平準確稱重并記錄。計算睪丸臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=睪丸質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。

    1.2.5 精子懸液的制備 頸椎脫臼處死小鼠后,立即取出附睪,用預溫的37℃生理鹽水沖洗2次,用眼科剪縱向剪開附睪,置于加有3mL 37℃的生理鹽水的試管中,在恒溫箱中孵育20min,使精子充分游離。

    1.2.6 精子的存活率 取出一定量的精子懸液,與等體積的伊紅迅速充分混勻,使其染色后,取出10μL加入紅細胞記數(shù)板中,400倍鏡下觀察一個視野中的精子存活情況,活細胞染成紅色,死細胞為無色(鏡下觀察為透明)。精子存活率=活精子數(shù)/(活精子數(shù)+死精子數(shù))×100%。

    1.2.7 生殖系統(tǒng)的病理觀察 睪丸形態(tài)的肉眼觀察:將各組雄性小鼠脫頸椎處死后,取出兩側(cè)睪丸,并觀察顏色及形態(tài)的變化。

    精子畸形變化的觀察:按照以上的精子觀察的方法,計數(shù)精子數(shù)量并觀察不同染毒組的小鼠精子的形態(tài)變化。

    睪丸組織形態(tài)觀察:將各組雄性小鼠脫頸椎處死后,取睪丸,立即放入100mL/L的福爾馬林溶液中固定,梯度乙醇脫水,透明后常規(guī)石蠟包埋,間斷均勻切片5張~10張,切片厚度為7μm,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察組織形態(tài)變化。

    1.2.8 統(tǒng)計學分析 表中數(shù)據(jù)代表4次重復試驗的平均值(±sD),結(jié)果用雙樣本t檢驗分析,P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 行為的變化

    液態(tài)甲醛染毒后可以引起小鼠的食量減少,飲水量減少;初期,小鼠有抓嘴、抓鼻、撓耳朵等行為,隨后小鼠出現(xiàn)高度興奮、躁動不安、站立,攀爬等行為;最后,出現(xiàn)群聚、懶惰、個別的鼠則出現(xiàn)走路拖曳、搖擺等現(xiàn)象,并且高濃度組中有幾只小鼠有毛發(fā)缺少光澤,糞便不成形且變成黃白色等現(xiàn)象。

    2.2 睪丸的臟器系數(shù)

    由表1表明隨染毒劑量的增加,睪丸的臟器系數(shù)呈降低趨勢。與對照組相比,低劑量(2mg/kg)組具有顯著性差異(P<0.05),而中劑量(20mg/kg)組與高劑量(200mg/kg)組差異極顯著(P<0.01)。

    表1 甲醛對睪丸臟器系數(shù)的影響Table 1 Effect of formaldehyde on testicle organ coefficient

    2.3 精子總數(shù)、存活率

    由表2表明隨著染毒劑量的增加,精子總數(shù)逐漸減少,精子存活率逐漸降低。與對照組相比較,低劑量組具有顯著性差異(P<0.05),而中、高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

    表2 甲醛對精子存活率的影響Table 2 Effect of formaldehyde on survive rates of the sperms

    2.4 生殖系統(tǒng)的病理觀察變化

    2.4.1 精子畸形的觀察 在400倍顯微鏡下觀察精子的頭部、體部和尾部的形態(tài)變化,出現(xiàn)雙頭狀、香蕉狀、無定形狀、肥胖以及雙尾、無尾、尾巴折疊等現(xiàn)象,這些精子均為畸形的精子,并隨染毒劑量的增加,精子畸變程度顯著升高,畸形的精子數(shù)量也逐漸增加。

    2.4.2 肉眼觀察 經(jīng)過解剖后,取出兩側(cè)睪丸觀察其顏色變化,對照組的顏色白色而有光澤;低濃度組與對照組接近;而中、高濃度組的顏色泛黃而無光澤,且表面可見紅色的毛細血管。

    2.4.3 組織形態(tài)觀察 對照組小白鼠的睪丸生精小管內(nèi)生精細胞豐富,層次分明,發(fā)育正常,管腔內(nèi)有許多精子,分布于支持細胞頂端(圖1A);低劑量組的各階段生精細胞基本正常,與對照組沒有顯著差異,但有部分細胞稀疏、變性、脫落,個別的小管內(nèi)可見精子出現(xiàn)水腫(圖1B);中劑量組小鼠睪丸病變進一步加重,出現(xiàn)廣泛性的生精細胞層次稀疏,生精細胞明顯水腫,生精細胞及支持細胞變性、壞死、脫落,小管內(nèi)可見個別變性水腫的精子(圖1C);高劑量組睪丸生精細胞層崩解減少,生精細胞廣泛脫落,小管內(nèi)生精上皮大多數(shù)水腫或皺縮,個別小管內(nèi)未見精子,僅見殘存的支持細胞(圖1D)。

    3 討論

    甲醛具有毒性,能對小鼠的生理及行為產(chǎn)生一定的影響,且甲醛溶液的濃度越高,染毒時間越長,其效果越明顯[8-9]。小鼠的行為變化與小鼠機體的生理活動和神經(jīng)支配有密切的聯(lián)系,有試驗已經(jīng)證明,當給小鼠注射甲醛溶液后,溶液滲入機體并對機體產(chǎn)生毒性效應,機體會通過周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)的相互作用而發(fā)出相應的信號,從而支配相應的行為變化[10]。本試驗通過對小鼠腹腔注射甲醛溶液后觀察其行為的變化,染毒后,小鼠的食量、飲水量均減少,由高度興奮、躁動逐漸變?yōu)槿壕?、懶惰,最后出現(xiàn)走路拖曳、搖擺等行為。

    甲醛對雄性小鼠的生殖器官有毒害作用,染毒后甲醛進入并作用于睪丸組織,對睪丸的生長及生理活動產(chǎn)生影響,從而造成睪丸組織的病理性變化,造成睪丸萎縮而使臟器系數(shù)降低[11-12]。本試驗研究表明隨著染毒劑量的升高,甲醛對小鼠生殖器官的毒性也增大,睪丸的臟器系數(shù)也變小,說明甲醛使小鼠睪丸發(fā)生了不同程度的萎縮。

    成年雄性小鼠的正常精子的產(chǎn)生、分化及成熟有賴于睪丸的生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞之間的密切協(xié)調(diào),并受到下丘腦-垂體-性腺軸的控制,其中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙時,都會使生殖系統(tǒng)發(fā)生障礙。生精小管(seminiferous tubule)是精子的發(fā)生地,主要由生精上皮構(gòu)成,生精上皮由支持細胞和生精細胞構(gòu)成。成年的雄鼠生精細胞不斷發(fā)育為精子,其順序為精原細胞-初級精母細胞-次級精母細胞-精子細胞-精子。生精細胞沿著生精小管的管腔由內(nèi)向外依次排列,睪丸間質(zhì)是生精小管之間的富含血管的疏松結(jié)締組織,生精小管與血液之間存在血-睪屏障,血睪屏障能阻止某些物質(zhì)進入生精上皮,從而維持精子形成的微環(huán)境,而支持細胞主要為生精過程提供營養(yǎng)、分泌激素等,同時也是生精細胞的附著場所。當給小鼠腹腔注射甲醛溶液時,毒物會通過血液滲入睪丸組織,進而破壞了血-睪屏障,進入生精小管,破壞了生精細胞的正常生長發(fā)育過程,同時,支持細胞的功能也受到了阻礙,從而出現(xiàn)生精細胞層次減少、稀疏、脫落的現(xiàn)象,支持細胞也變性、壞死、脫落,整個過程將影響了精子的發(fā)生,從而使精子數(shù)量減少[13],并引起睪丸細胞DNA的損傷[14]。本試驗研究表明,經(jīng)過染毒后的小鼠睪丸組織發(fā)生病變,低濃度組的睪丸組織的生精細胞稀疏,中濃度組的變性、壞死、脫落,精子出現(xiàn)水腫,高濃組的壞死、脫落,并且隨著染毒劑量的增大,受損程度更加明顯。

    圖1 不同濃度甲醛處理的睪丸組織病理切片觀察(400×)Fig.1 Observation of testicle tissue section treated by different formaldehyde concentrations(400×)

    足夠的精子數(shù)量是維持正常生育力的重要前提,在評價有害因素對雄性生殖健康的影響時,精子數(shù)量的改變比其他指標更為敏感。精子計數(shù)是評價生殖毒性效應的重要指標,可反映生精細胞的功能[15]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),小鼠經(jīng)甲醛染毒后,隨著染毒劑量的增加,各染毒組的精子數(shù)量、精子存活率均明顯降低,與對照組比較有極顯著性差異,表明甲醛能抑制精子的發(fā)生,干擾精子的形成和生長過程。

    目前認為,精子形態(tài)由多基因遺傳控制,常染色體上的基因控制精子畸形的類型,性連鎖基因Y-基因控制畸形精子的數(shù)量,因此,精子畸形率的增加在一定程度上反映出雄性生殖細胞的遺傳損傷。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲醛能使精子畸形的數(shù)目增加,引起嚴重的生殖毒性作用[9,15]。本試驗通過使小鼠染毒,并觀察不同劑量組的精子畸形的變化,表明甲醛溶液染毒后能影響精子的形成及生長發(fā)育過程,使精子發(fā)生不同程度的畸變,并隨染毒劑量的增加,精子畸變程度顯著升高,畸形的精子數(shù)量也逐漸增加。

    本研究通過甲醛腹腔注射使小鼠染毒,證明了甲醛能夠滲透并作用于睪丸組織,造成生殖器官萎縮,影響雄性小鼠的生精過程,造成睪丸組織的病理損傷,使精子生成數(shù)目減少,同時對精子的成熟過程造成一定的影響,使精子形態(tài)發(fā)生異常改變,畸變精子數(shù)目增加,直接影響生殖系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮。

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