牛支原體的分離鑒定及16SrRNA基因序列分析

伍曉紅，儲岳峰，張 軒，趙 萍，高鵬程，賀 英，逯忠新＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅蘭州730046；2.西藏昌都左貢縣獸醫(yī)站，西藏左貢854400）

牛支原體（Mycoplasma bovis）主要引起牛的肺炎、關節(jié)炎、乳房炎、角膜結膜炎等［1］。該病原于1961年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離得到，之后在歐洲和北美流行并造成了嚴重的經(jīng)濟損失［2］。辛九慶等［3］首次在國內(nèi)患肺炎犢牛的肺臟中分離到牛支原體，從而證實了國內(nèi)部分地區(qū)也存在牛支原體肺炎的流行。冉智光等［4］又從患嚴重肺炎和關節(jié)炎的調(diào)入肉牛中分離出了牛支原體，進一步證實牛支原體感染已經(jīng)對中國部分地區(qū)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展造成了嚴重的影響。

有關研究報道，在健康牛呼吸道中幾乎分離不到牛支原體，只有在感染牛的呼吸道中能夠分離到，并經(jīng)常引起臨床發(fā)?。?］。近年來，在我國不同地區(qū)相繼有犢牛肺炎病例發(fā)生，由于在臨床癥狀和病理剖檢變化方面與牛傳染性胸膜肺炎非常相似，曾引起養(yǎng)牛業(yè)界的恐慌［6］。2011年，甘肅通渭某牛場出現(xiàn)嚴重的犢牛呼吸系統(tǒng)感染，主要表現(xiàn)為肺炎癥狀，病死率達10%。本研究對送檢的犢牛肺臟病料進行了支原體分離和鑒定，并通過16 S RNA基因測序進行了分子鑒定，證實為牛支原體。

1 材料與方法

1.1 材料

采集甘肅通渭發(fā)病犢牛病變肺臟樣品2份；用Thiaucourt＇s支原體培養(yǎng)基分離［7］。

1.2 方法

1.2.1 病原分離 無菌取約1 g肺組織，加2 mL液體培養(yǎng)基研磨勻漿，1 000 r／min離心5 min取上清，按1∶10倍比稀釋接種至液體培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種2管，共接種3個稀釋度，置37℃培養(yǎng)。每隔48 h進行一次傳代或盲傳。傳至2代后取培養(yǎng)基顏色變黃且不渾濁者或輕微渾濁者，接種于固體培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h～96 h，挑取單個克隆接種液體培養(yǎng)基，待生長后再接種固體培養(yǎng)基，至少3次克隆純化后，用甘油將培養(yǎng)物保存于－70℃。

1.2.2 生化試驗 參考文獻［8］的方法進行生化試驗。

1.2.3 PCR鑒定 使用北京天根生化科技有限公司的細菌基因組DNA抽提試劑盒提純培養(yǎng)物基因組DNA。利用牛支原體特異性引物P1：5′－TTTTAGC － TCTTTTTGAACAAAT－3′， P2： 5′－GGCTCTCATT－AAGAATGTC－3′對分離物進行PCR 鑒定［9］。

1.2.4 16 SrRNA序列測定與分析 根據(jù)已發(fā)表文獻［10］報道的方法擴增支原體培養(yǎng)物16 SrRNA基因序列，預計擴增片段長度為1.6 kb。將PCR擴增產(chǎn)物連接到T載體中送去南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序，用Lasergene 7.01軟件中的Meg Align程序?qū)y序結果與部分支原體菌株的16 SrRNA序列進行比對分析。

2 結果

2.1 病原分離

在液體培養(yǎng)基中盲傳2代后，2份樣品的培養(yǎng)基顏色開始變黃，呈輕微混濁狀。將培養(yǎng)物純化，獲得2份純培養(yǎng)物，分別命名為GT－01和GT－02。GT－01和GT－02在固體培養(yǎng)基生長，72 h后可觀察到針尖狀大小的菌落，低倍普通光學顯微鏡下可看到菌落呈圓形，邊緣整齊，具有典型的“油煎蛋狀”形態(tài)（圖1）。

圖1 GT－01株的純化菌落形態(tài)（40×）Fig.1 Colony of the isolate GT－01（40×）

2.2 生化試驗

GT－01和GT－02培養(yǎng)物均對洋地黃皂甙敏感，具有磷酸酯酶活性，四氮唑還原試驗陽性，但不能水解葡萄糖、甘露醇、精氨酸，不消化酪蛋白，與已報道牛支原體生化特性相符。

2.3 PCR鑒定

利用牛支原體特異性的P1和P2引物可以從GT－01和GT－02基因組總DNA中擴增出約1 911 bp的片段，與預期片段大小相符（圖2）。

圖2 牛支原體分離物PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification of mycoplasma isolates

2.4 16 S rRNA基因序列分析

16 S rRNA基因序列分析表明，GT－01和GT－02序列同源性為99.9%；與GenBank中公布的其他5株不同的支原體16 S rRNA基因進行同源性分析，GT－01和GT－02與牛支原體標準株PG45同源性分別高達99.4%和99.6%。

圖3 GT－01和GT－02分離株16 S rRNA基因序列的同源性分析Fig.3 Homology analysis of 16 S rRNA gene of the isolates GT－01 and GT－02

3 討論

盡管牛支原體可引起多系統(tǒng)感染，但呼吸道感染是牛支原體主要的致病表型之一，牛支原體肺炎已成為當前世界上許多國家和地區(qū)牛的重要呼吸道傳染病，對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。感染牛可通過呼吸道傳播成為主要的傳染源，其傳播過程可持續(xù)幾個月甚至幾年。Laak E A等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在荷蘭育肥牛場中牛支原體感染率在20%以上。英國的某項調(diào)查顯示，55個牛場中有半數(shù)牛場可檢測到牛支原體特異性抗體［12］。在瑞士，牛支原體導致的呼吸道疾病占牛全部呼吸道疾病的50%，感染牛群生長速度下降8%［13］。2008年，我國湖北省新從外地引進肉牛發(fā)生了以壞死性肺炎為主要特征的呼吸道傳染病，引起了很高的發(fā)病率和病死率，后確定該病為牛支原體引起的“傳染性牛支原體肺炎”［10－14］，證實了該病在我國流行，此后又蔓延至重慶等全國等多個地區(qū)，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了較大危害。本研究首次從甘肅地區(qū)臨床表現(xiàn)肺炎的犢牛肺組織中分離到牛支原體，證實該病已在甘肅省存在，給當?shù)仞B(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)提出了新的挑戰(zhàn)。

在牛支原體引起的呼吸系統(tǒng)感染臨床診斷中，由于臨床癥狀和病理剖檢變化與牛傳染性胸膜肺炎（牛肺疫）類似，需進行較為準確的實驗室診斷。實驗室診斷主要包括病原學和血清學診斷兩個方面。目前國內(nèi)還沒有有效的血清學診斷方法，國外試劑盒價格昂貴，且需要采集感染不同時期的血清進行比對以輔助診斷。因此，病原分離和分子鑒定成為目前較為可行的確診依據(jù)［3］。本試驗使用的特異性PCR引物，對無乳支原體標準株PG2和牛肺疫支原體PG1株均無交叉擴增，與原文獻報道的可用于鑒別牛支原體和無乳支原體結果一致［9］，因此具有較好的特異性，是一種快捷方便的分子診斷手段。

16 SrRNA基因序列分析表明，來自于同一牛場的GT－01和GT－02兩個分離株同源性為99.9%，表明二者之間具有一定的差異，這是否意味著同一牛場可能同時流行不同的菌株，或者牛支原體在流行過程中能發(fā)生快速變異，尚需要進一步研究。與GenBank中的其它支原體種的序列比對分析表明，分離株與牛支原體標準株PG45同源性分別為99.4%和99.6%，而與無乳支原體的同源性僅為98.6%，進一步從基因序列水平上證實了分離株為牛支原體。

2008年以來，我國已有多個省市已證實牛支原體肺炎的流行，本試驗首次證實了該病在甘肅省存在，表明該病在我國有逐漸蔓延之勢。隨著我國奶牛業(yè)和肉牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牛群的調(diào)運將會愈加頻繁，牛支原體傳播擴散的風險也將提高，應引起各級獸醫(yī)部門的重視，提高對牛支原體肺炎的認識，加強對該病的防控措施。

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