鴨瘟病毒YZH株的分離鑒定及其TK基因的序列分析

余愛花，楊 陽，張寶來，谷長勤，張萬坡，程國富，胡薛英＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070；2.天津市津南區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，天津300350）

鴨瘟是鴨、鵝及多種雁形目動物的一種急性、高致死率的傳染?。?］，又稱鴨病毒性腸炎。在我國廣大養(yǎng)鴨地區(qū)該病多見于成年種鴨和蛋鴨，主要表現(xiàn)感染鴨軟弱、下痢、流淚和部分病鴨出現(xiàn)頭頸部腫脹；食道黏膜出血或潰瘍，泄殖腔黏膜出血與壞死，肝出血或有壞死灶［2］。目前該病的診斷主要依賴流行病學(xué)、臨床癥狀和剖檢變化及病毒的分離、鑒定。該病的病原為鴨瘟病毒（Duck plague virus），屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，核酸為線狀雙股DNA［3］。國內(nèi)外學(xué)者對鴨瘟病毒引起的病理變化和鴨瘟病毒的抗原定位有較多的研究，如Francisco J等［4］較為詳細(xì)地研究了鴨瘟病毒感染水禽引起的各組織病理變化；Plummer P J等［5］根據(jù)UL6段保守區(qū)序列并設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)片段；胡薛英等［6］應(yīng)用單克隆抗體的免疫組織化學(xué)法研究雛鴨體內(nèi)鴨瘟病毒的分布；謝芝勛等［7-8］對鴨瘟病毒核酸進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果良好。

目前對鴨瘟病毒基因結(jié)構(gòu)及功能的研究比較少，僅報導(dǎo)了部分毒株的UL6，UL7基因，TK基因，聚合酶基因的克隆和測序［9-12］。胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因是皰疹病毒的主要毒力基因和病毒增殖的非必需基因［13］，其編碼產(chǎn)物胸苷激酶是嘧啶生物合成補(bǔ)救途徑中所必需的酶。它可使胸腺嘧啶磷酸化為dTMP，然后繼續(xù)磷酸化成為dTTP，參于病毒DNA的合成，在神經(jīng)組織感染及潛伏性感染中具有重要作用［14-15］。研究TK基因的結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白為進(jìn)一步研究鴨瘟病毒的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用動物櫻桃谷鴨2周齡，購自武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，未進(jìn)行任何免疫接種及藥物治療；DNA病毒基因組提取試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)PremixTaqDNA聚合酶，DNA Marker D L 2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集和處理 病料采自湖北省武漢市某養(yǎng)鴨場送檢20日齡商品代櫻桃谷肉鴨，病死率90%。采集送檢病鴨的肝組織病料剪碎，按1∶5的比例加入滅菌PBS（0.2mol／L，pH 7.2）勻漿，6 000 r／min離心20min，取上清液，220nm微孔濾膜過濾，用滅菌的PBS稀釋20倍后作為接種材料。

1.2.2 鴨瘟病毒TK基因的序列分析

1.2.2.1 病毒DNA的提取 分別取送檢死亡鴨的肝臟和空白組剖殺鴨的肝臟，加滅菌PBS于研磨器中研磨，后置于1.5mL中反復(fù)凍融3次，6 000 r／min離心15min，取上清液備用。嚴(yán)格按照DNA病毒基因組提取試劑盒說明書操作。

1.2.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的DPV序列，使用Primer5.0設(shè)計引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成了如下引物。上游引物：5′-TCACTGCGCGACTCTTGCGAACG-3′；下 游引 物： 5′-ATTAATTGTCATCTCGGTATTGTATT-3′。目的片段為1 077bp，使用前將引物稀釋、分裝、置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增 對影響PCR的主要條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度（50℃～60℃）和引物濃度（0.1μmol／L～0.6μmol／L）。最佳PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系采用25μL反應(yīng)量：2×PremixTaqDNA聚合酶12.5μL；上游引物（10mmol／L）1.0μL；下游引物（10mmol／L）1.0μL；模板2.0μL；滅菌超純水8.5μL；總體積25.0μL。根據(jù)梯度PCR擴(kuò)增結(jié)果，目的片段的最適退火溫度為50℃，擴(kuò)增條件為：95℃5min；94℃1min，50℃1min，72℃1min，33個循環(huán)；72℃7min；10℃60min。產(chǎn)物于1.0 g／L瓊脂糖凝膠中電泳，檢測擴(kuò)增情況。

1.2.2.4 測序與序列分析 純化回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，使用DNA Star軟件將YZH-TK序列與GenBank上已發(fā)表的鴨瘟病毒TK基因序列進(jìn)行比對分析。

1.2.3 動物回歸試驗 12羽健康雛鴨分為2組，攻毒組6只，每只接種0.2mL病毒稀釋液。對照組6只，每只接種0.2mL滅菌的PBS。隔離飼養(yǎng)，觀察。待雛鴨死亡時，剖檢并記錄病變，采取組織病料用100mL／L福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察。取胸腺，2.5mL／L戊二醛溶液固定，備做透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 DEV的PCR鑒定

用設(shè)計合成的鴨瘟病毒TK基因核苷酸序列擴(kuò)增引物，對DPV基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳顯示在1 000bp附近有一條帶出現(xiàn)，與預(yù)計片段大小（1 077bp）相符（圖1）。

圖1 鴨瘟病毒TK基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of duck plague virus TK gene

2.7 鴨瘟病毒TK基因序列的測定分析

所鑒定的病毒與GenBank發(fā)表的序列AY963569進(jìn)行比較，同源性可達(dá)到99.16%。與GenBank上已發(fā)表的鴨瘟病毒TK基因序列AY911509、EF173464、AY963569、DQ640611 和EF053033鴨瘟病毒UL23序列、人皰疹病毒TK基因序列EU541367、鶉雞皰疹病毒1型TK基因序列AY741134、獼猴皰疹I(lǐng)型病毒TK基因序列EF426678做遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，此次分離到的病毒與已發(fā)表的幾株鴨瘟病毒TK基因在同一分枝，且同源性均可達(dá)到99%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性均可達(dá)96%以上（圖2和圖3）。

2.1 動物回歸試驗

2.1.1 臨床癥狀和剖檢病變 接種后3d，攻毒組鴨表現(xiàn)流淚，整群雛鴨表現(xiàn)精神沉郁，匍匐，不愿站立。接種后4d到第8天，攻毒組共死亡4羽。剖檢死亡鴨可見肝腫大，質(zhì)脆，表面有彌散性大小不一的出血點和灰白色壞死灶（圖4）；脾臟極度腫脹，胰腺有白色壞死點；腸道漿膜面可見紅色環(huán)狀出血帶，亦可見針尖大小的紅色斑點（圖5）。法氏囊有出血點。而對照組無異常。

圖2 皰疹病毒中TK基因序列編碼氨基酸的遺傳進(jìn)化樹分析Fig.2 The Phylogenetic tree analysis of deduced amino acid sequenees of TK gene in Alphaherpesvirinae

圖3 皰疹病毒中TK基因推導(dǎo)氨基酸的同源性比較Fig.3 Homology comparison of deduced amino acid sequences of TK gene in Alphaherpesvirinae

圖4 感染雛鴨的肝臟Fig.4 The liver of infected ducklings

圖5 感染雛鴨的腸道Fig.5 The intestine of infected ducklings

2.1.2 組織切片觀察 肝臟：感染后肝細(xì)胞發(fā)生水泡變性、脂肪變性，中央靜脈周圍有炎性細(xì)胞的浸潤。壞死灶分布廣泛，呈均質(zhì)紅染無結(jié)構(gòu)狀，壞死灶中出現(xiàn)異嗜性粒細(xì)胞的浸潤，并有少量吞噬了異物的巨噬細(xì)胞，有出血病變。

十二指腸：黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，固有層至肌層可見淋巴濾泡增生，濾泡中的淋巴細(xì)胞有排空現(xiàn)象，并出現(xiàn)壞死；黏膜下層表現(xiàn)出血病變（圖6）。

食道：黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死，固有層、黏膜下 層組織有出血和水腫（圖7）。

圖6 感染雛鴨的腸道（HE）Fig.6 The intestine of infected ducklings

圖7 感染雛鴨的食道（HE）Fig.7 The oesophageal of infected ducklings

法氏囊：感染后黏膜上皮細(xì)胞脫落，固有層水腫，淋巴濾泡髓質(zhì)發(fā)生凝固性壞死；皮質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)量急劇減少，網(wǎng)狀細(xì)胞增多，出現(xiàn)巨噬細(xì)胞；固有層發(fā)生水腫、出血；嚴(yán)重時，髓質(zhì)區(qū)淋巴濾泡失去固有結(jié)構(gòu)，只剩下一些網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和少量淋巴細(xì)胞。

2.1.3 電鏡觀察 接種病毒后7d，可見胸腺中有的細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，胸腺中有多個壞死細(xì)胞，在壞死崩解的細(xì)胞中觀察到直徑100nm～180nm，有囊膜圓形的病毒粒子（圖8）。

圖8 胸腺中可見病毒粒子Fig.8 The viral particles in thymus

3 討論

鴨瘟病毒感染造成的病死率和病變有較大的差異。家養(yǎng)鴨感染的總病死率為5%～100%不等。臨床臨床以急性敗血癥過程為特征，表現(xiàn)為精神沉郁，兩腿麻痹，下痢，流淚和部分病鴨頭頸腫大［16］。該病為一種廣泛嗜全身性感染的傳染病。本試驗人工感染病例表現(xiàn)肝臟的腫大、壞死和出血；胸腺，法氏囊，食道黏膜出血等病理變化，與報道的鴨瘟的臨床癥狀，病理變化等相一致［5］；在胸腺透射電鏡結(jié)果中可觀察到球形，直徑100nm～180nm，有囊膜，圓形的病毒粒子，與報道的鴨瘟病毒粒子的形態(tài)相符［17］。因此確診此次送檢的病例為鴨瘟病毒感染。在易感動物體內(nèi)，病毒在法氏囊、胸腺、脾臟和肝臟的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖［1］，因此本研究采樣胸腺作為電鏡檢測病毒的材料。

DPV自然易感宿主僅限于鴨、鵝和天鵝，7日齡到成年種鴨均可感染［1］，因此本研究中感染動物主要為雛鴨，雛鴨感染的病理變化呈現(xiàn)出典型的鴨瘟病毒感染的特征［1］。

本試驗根據(jù)已發(fā)表鴨瘟病毒TK基因片段的序列，設(shè)計合成引物，利用PCR特異地擴(kuò)增出1 077 bp片段。將該基因片段的序列與已報道序列比較發(fā)現(xiàn)，二者的同源性為99.16%。與GenBank上已發(fā)表的鴨瘟病毒TK基因序列AY911509、EF173464、AY963569、DQ640611和 EF053033鴨瘟病毒UL23序列、人皰疹病毒TK基因序列EU541367、鶉雞皰疹病毒1型TK基因序列AY741134、獼猴皰疹I(lǐng)型病毒TK基因序列EF426678做遺傳進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)其與AY911509、EF173464、AY963569、DQ640611序列同源性均大99%，氨基酸同源性分別為97.2%、97.6%、97.6%、97.7%。

TK蛋白有2個活性中心，分別是位于N端的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域DGPYGTGK和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域DRH。ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域代表皰疹病毒TK蛋白的核心序列，它形成了一個疏水的袋狀構(gòu)象，以便與ATP腺嘌呤環(huán)結(jié)合。而在DPVTK基因的兩個活性中心分別位于31位～39位和133位～135位，其中的3個氨基酸殘基（G）中的1個發(fā)生突變，則會影響TK蛋白的構(gòu)象及其與APT的結(jié)合，導(dǎo)致TK蛋白功能喪失而致弱［18-19］。本研究中根據(jù)TK基因序列推導(dǎo)出的核苷酸序列中兩個活動中心序列ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域未發(fā)生改變，而其第6位氨基酸由S（Ser）變?yōu)镕（Phe），從第12開始到22氨基酸序列都發(fā)生了改變，這種改變是否會對病毒蛋白翻譯和毒力產(chǎn)生影響還有待于進(jìn)一步研究。

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