豬A組輪狀病毒實時熒光定量PCR 檢測方法的建立

高婉俊，王 靜，林 鷙，曹偉偉，張彥明

（西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100）

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是引起嬰幼兒和多種幼齡動物急性病毒性腹瀉的主要病原體［1］。仔豬輪狀病毒性腹瀉是由豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）引起的，感染PoRV的仔豬會出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂等癥狀［2］，而且容易繼發(fā)其他細菌性感染［3］，導致仔豬病死率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，PoRV與人的非典型RV有密切的關系［4－6］，豬可能會成為人類新型RV的“貯存器”。

PoRV的基因組由11個雙鏈RNA節(jié)段構成，分別編碼6個結構蛋白（VP1～VP4、VP6、VP7）和6個非結構蛋白（NSP1～NSP6）。其中，VP6由第6基因編碼，占病毒蛋白總量的51%，是內層衣殼的主要組成成分，并且具有轉錄酶活性，在RV的復制過程中發(fā)揮重要作用［7］。根據RV抗原VP6的差異可將其分為7個組（A～G），其中A、B、C、E組RV可感染豬，且在豬群中感染最為普遍的是A組RV。VP6具有很強的免疫原性，可刺激機體產生Ig A、IgG，并且具有組特異性，因此，VP6在輪狀病毒感染的診斷上是一個重要的檢測指標［8］，而且在疫苗開發(fā)方面有潛在的應用價值［9－10］。

目前，RV的檢測方法主要有電鏡觀察、ELISA［11－12］、核酸聚丙烯酰胺凝膠電泳［13］、核酸雜交和 RT－PCR［14］，以及實時熒光定量 PCR［15］。經典的病原檢測方法是電鏡技術（EM）和分離培養(yǎng)。但是EM技術設備昂貴，病料處理繁瑣，并且要求每毫升樣品中至少包含約106個病毒顆粒［16］，敏感性不高，不適合大規(guī)模臨床檢測。ELISA方法雖然操作簡單，可肉眼判斷結果，但特異性和靈敏性相對較低，且不能有效地進行定量檢測［17］。檢測病毒基因組RNA的PAGE電泳方法特異性和靈敏度較好，能在基因水平上對不同毒株間的異同進行初步分析，但是這種方法操作繁瑣且所需時間較長，容易造成RNA的降解，從而影響檢測結果。RT－PCR方法雖然是目前RV檢測方法中特異性較強的方法，但不能夠準確定量，而且反應結果需要電泳后才能判斷。實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比，除了靈敏度更高和特異性更強外，自動化程度高，無污染、實時性好，能實現(xiàn)多重反應，而且結果準確可靠。目前實時熒光定量PCR技術已得到廣泛應用，成為病毒檢測的有效手段。本試驗擬建立一種基于VP6基因的有效檢測PoRV的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法，并與常規(guī)RTPCR方法進行了比較，旨在為PoRV的檢測提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 冷凍離心機，德國Eppendorf公司產品；iQ5熒光定量PCR儀，美國Bio－Rad公司產品；普通PCR儀，Bio－Rad公司產品；NanoDrop ND－1000型紫外分光光度計，美國Thermo Scientific公司產品；凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司產品。p MD 19－T Vector、PrimeScript RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，寶生物工程（大連）有限公司產品；Trizol Reagent，Invitrogen公司產品；柱離心型DNA凝膠回收與純化試劑盒和高純質粒小量提取試劑盒，威格拉斯生物技術（北京）有限公司產品。

1.1.2 病毒株及細胞系 豬輪狀病毒OSU株（G5型）和羅猴腎細胞系（MA－104）均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬瘟病毒石門株（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬圓環(huán)病毒－2型（PCV－2）均由西北農林科技大學預防獸醫(yī)學平臺實驗室保存；永生化豬小腸黏膜上皮細胞系（SIEC），由本實驗室建立并保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank中登錄的PoRV OSU株 VP6基因序列（AF317123.1）用Primer Premier 5軟件設計了一對擴增VP6基因片段的特異性引物，上游引物 P1：5′－TGCTGGATCAGAAATTCAGG－3′，下游引物P2：5′－TAGTGGCACGACATGTTCAA－3′，預期擴增產物長度為94 bp，該引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2.2 質粒標準品的制備

1.2.2.1 病毒 RNA 的提取 復蘇 MA－104細胞于直徑60 mm的細胞培養(yǎng)皿中，至細胞鋪滿皿底的80%時，用無血清的MEM培養(yǎng)基沖洗3次，接入事先用胰酶激活的豬輪狀病毒稀釋液，37℃吸附1 h。吸附結束后吸出病毒液，用無血清的MEM培養(yǎng)基于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收取細胞培養(yǎng)物。取200μL培養(yǎng)物加入1 mL Trizol Reagent混勻，室溫靜置5 min；加入200μL氯仿，顛倒混勻30 s，4℃、12 000 r／min離心15 min，小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，震蕩混勻，室溫靜置10 min；4℃、14 000 r／min離心10 min，棄上清；沉淀用800μL 750 mL／L的乙醇于4℃、8 500 r／min離心5 min洗滌兩次，棄上清，沉淀干燥5 min；以20μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2.2 cDNA的逆轉錄合成 按照寶生物工程（大連）有限公司生產的PrimeScript RT Reagent Kit說明書進行，采用20μL體系：5×PrimeScript buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1μL，Oligo d T primer（50 μmol／L）1μL，Random 6 mers（100μmol／L）1μL，RNA Template 6μL，最后用 RNase Free d H2O補足20μL；按以下程序進行反轉錄反應：37℃15 min，85℃5 s。合成的cDNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 PoRV標準品的制備與鑒定 以cDNA為模板進行PCR反應，采用25μL反應體系：2×Taq Master Mix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，反轉錄產物4μL，滅菌雙蒸水7.5μL。PCR反應條件為：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃15 s，35個循環(huán)；72℃10 min；12℃終止反應。取擴增產物于20 g／L瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結果。切取目的片段用DNA凝膠回收與純化試劑盒純化回收，與p MD 19－T Vector連接后轉化 DH5α感受態(tài)細胞。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)板上37℃培養(yǎng)12 h～16 h，挑取單個菌落，增菌后用質粒小量提取試劑盒提取質粒進行PCR鑒定，將篩選的陽性重組質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。用DNA Star軟件與GenBank上已有的OSU株VP6基因序列進行比對分析。挑取序列正確的質粒作為標準品，用紫外分光光度計測濃度后根據公式計算拷貝數［17］。

1.2.3 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.3.1 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化 為了得到更高的熒光增幅并使反應有最小的循環(huán)數（Ct），對熒光定量PCR的循環(huán)條件進行兩步法和三步法摸索，并將退火溫度從55℃依次遞增至60℃，遞增步長為1℃，對退火溫度進行優(yōu)化。

1.2.3.2 熒光定量PCR敏感性試驗及標準曲線的建立 將質粒標準品10倍系列稀釋，使其濃度在1.0×101～1.0×109拷貝／μL之間，按1.2.3.1中優(yōu)化后的反應條件進行PCR反應，并設置以d H2O為模板的陰性對照，觀察該方法的敏感性，標準曲線由iQ5熒光定量PCR儀自動生成，X軸代表每個濃度標準品模板中所含病毒起始含量以10為底的對數，Y軸代表各個梯度質粒標準品擴增時達到閾值所需的循環(huán)數。

1.2.3.3 特異性試驗 用豬輪狀病毒OSU株（PoRV）、豬瘟病毒石門株（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的cDNA以及豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）的基因組DNA為模板進行熒光定量PCR，并以稀釋度為1.0×108拷貝／μL的質粒標準品為陽性對照，并設置以dd H2O為模板的陰性對照，檢驗該方法的特異性。

1.2.3.4 重復性試驗 選取1.0×106拷貝／μL的質粒標準品，在同一批次內重復10次，計算批內變異系數；并在不同時期將該質粒標準品分別再重復10個批次，每次3個重復，取平均值，計算批間變異系數，檢驗該方法的重復性。

1.2.4 熒光定量PCR與普通RT－PCR的比較 將1.0×1010～1.0×101拷貝／μL的質粒標準品分別進行常規(guī)RT－PCR和熒光定量PCR，對比2種方法的靈敏度。

1.2.5 熒光定量PCR的初步應用 給永生化豬小腸黏膜上皮細胞（SIEC）接種病毒（MOI＝30），分別在感染后24、48、72 h收獲細胞以及上清液，用Trizol法提取細胞總RNA以及病毒液的基因組RNA，測濃度后進行反轉錄，用已建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測細胞內以及上清液中Po RV的含量。

2 結果

2.1 靶基因的擴增及驗證

經RT－PCR擴增，得到大小約為94 bp的目的片段，與預期結果相符（圖1）。將此特異性片段與p MD 19－T Vector連接，并對重組質粒p MD 19－TVP6進行測序，測序結果經BLAST分析，結果顯示，擴增的目的片段與PoRV OSU株VP6基因序列的一致性為100%，并且與NCBI數據庫中其他豬A組輪狀病毒毒株，如豬A組輪狀病毒Wa株同源性大于90%，說明對該毒株進行檢測對其他豬A組輪狀病毒具有參考意義。

圖1 PoRV引物特異性的RT－PCR鑒定Fig.1 Specificity of primers for PoRV detected by RT－PCR

2.2 敏感性試驗及標準曲線的建立

用紫外分光光度計測得重組質粒DNA的濃度為178 ng／μL，根據公式［18］，經過計算得出其拷貝數約為1.0×1011拷貝／μL，對該質粒進行10倍梯度稀釋，選擇1.0×109～1.0×101拷貝／μL的質粒作為模板，按照優(yōu)化的最佳反應條件：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各0.8μL，模板1μL，滅菌雙蒸水7.4μL，總體積20μL；最佳反應條件為：95℃30 s；95℃5 s，58℃20 s，72℃15 s，40個循環(huán)進行SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應，從圖2可以看出，本研究建立的熒光定量PCR方法的檢測靈敏度最低可達到1.0×101拷貝／μL。在1.0×109～1.0×102拷貝／μL范圍內線性關系良好，經iQ5熒光定量PCR儀軟件自動分析得到了熒光定量PCR方法的標準曲線（圖3）。擴增效率E＝95.7%，相關系數R2＝0.999。

圖2 Po RV熒光定量PCR方法的敏感性試驗結果Fig.2 Sensitivity test of real time fluorescent quantitative PCR for PoRV detection

圖3 實時熒光定量PCR方法的標準曲線Fig.3 The standard curve forreal time fluorescent quantitative PCR

2.3 熔解曲線的分析

從熔解曲線分析可知，在熔解溫度Tm＝81℃±0.5℃出現(xiàn)單一的特異性峰，表明該反應特異性良好（圖4）。

圖4 實時熒光定量PCR熔解曲線的建立Fig.4 The melting curve for real time fluorescent quantitative PCR

2.4 特異性試驗結果

采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測PoRV、CSFV、PRRSV、TGEV 和PCV－2，用1.0×108拷貝／μL的質粒標準品作為陽性對照，只有陽性對照和PoRV出現(xiàn)有效擴增的熒光信號（圖5），表明本研究建立的熒光定量PCR方法對Po RV有良好的特異性。

圖5 PoRV熒光定量PCR方法的特異性試驗結果Fig.5 Speciality test of real time fluorescent quantitative PCR for PoRV detection

2.5 重復性試驗

取1.0×106拷貝／μL的質粒標準品進行重復10次的批內試驗，從擴增曲線（圖6）及對應的Ct值（表1）可以看出，該質粒標準品的批內變異系數為0.43%；將其分為不同的時期測定10次，每次3個重復，結果顯示該質粒標準品的批間變異系數為1.42%，說明本研究建立的熒光定量PCR方法具有良好的重復性（表1）。

圖6 PoRV熒光定量PCR方法的重復性試驗結果Fig.6 Pepeatability test of real time fluorescent quantitative PCR for PoRV detection

2.6 熒光定量PCR方法與普通RT－PCR方法的比較

以1.0×1010～1.0×101拷貝／μL的質粒標準品為模板，每個濃度取1.0μL分別進行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR和普通RT－PCR。SYBR GreenⅠ熒光定量PCR對質粒標準品的檢測下限為1.0×101拷貝／μL，而普通RT－PCR的檢測下限為1.0×103拷貝／μL（圖7），表明SYBR GreenⅠ熒光定量PCR比普通RT－PCR靈敏度高出2個數量級。

2.7 Po RV感染SIEC不同時間段細胞及上清液中病毒量的檢測

用本試驗所建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對永生化豬小腸黏膜上皮細胞（SIEC）感染了PoRV OSU株（MOI＝30）24、48、72 h的細胞內及上清液中的病毒含量進行檢測，結果見表2。

表1 實時熒光定量RT－PCR檢測PoRV的組內及組間統(tǒng)計結果Table1 The intragroup and intergroup statistical results of PoRV detection by florescence quantitative real time fluorescent quantitative RT－PCR

圖7 10倍梯度稀釋的質粒標準品常規(guī)PCR擴增結果Fig.7 Amplification results of standard plasmid of 10 fold＇s serial dilution through the conventional PCR

表2 PoRV感染SIEC不同時間段細胞內及上清液中病毒量的檢測結果Table2 The results of real－time PCR of viral loads in SIEC and supernatant at different periods after infection with PoRV

3 討論

輪狀病毒是引起人和各種幼齡動物病毒性腹瀉的主要病原，在世界范圍內威脅著人類的健康和影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展［18］。豬輪狀病毒常呈地方流行性，常與豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、大腸埃希菌、沙門菌等混合感染，造成仔豬死亡率升高。許多成年豬往往會發(fā)生隱性感染并不斷向外排毒，成為主要的傳染源，因此，迫切需要建立一種能夠在Po RV感染初期進行檢測的方法。

近年來，熒光定量PCR結合熔解曲線分析方法在病原體檢測方面得到了廣泛的應用［19－21］，該技術可實現(xiàn)定量檢測，比傳統(tǒng)的PCR方法具有更高的靈敏度和特異性，其應用價值已得到廣泛的認可。熒光定量PCR技術有探針法和SYBR GreenⅠ染料法兩種方法。探針法較SYBR GreenⅠ染料法特異性高、敏感性好，但探針區(qū)域若發(fā)生變異將會導致假陰性結果，對于極易發(fā)生變異的區(qū)域，雖采用多個探針可以避免這一缺陷，但探針設計、標記及純化成本高，技術上的困難較難克服，雙重探針尤為困難，因此探針法不適合大規(guī)模的臨床應用。相反，基于SYBR GreenⅠ染料的熒光定量PCR技術成本低廉，只需要設計出特異性的引物即可有效地進行病毒拷貝數的檢測，雖然引物二聚體及非特異性擴增可能會影響檢測結果的特異性，但結合熔解曲線分析后便可有效克服這一缺陷，因此SYBR GreenⅠ染料法對于臨床樣品的檢測更具實際意義。

目前將實時熒光定量PCR技術用于檢測人輪狀病毒的研究比較普遍，而用于動物輪狀病毒的研究較為少見。Pang X L等［22］針對人A組輪狀病毒的NSP3基因保守區(qū)設計引物，建立了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，并將該方法與傳統(tǒng)的電鏡技術和普通套式PCR方法進行比較，證明熒光定量PCR檢測技術比上述兩種檢測方法高出4個數量級，而且用時更少、操作更簡便，不容易造成污染。陳小金等［23］根據豬輪狀病毒OSU株的VP7基因序列設計了一對特異性引物，建立了豬輪狀病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性和重復性進行了評價，但是作為檢測的靶標，作為組抗原并且含量最為豐富的VP6是更好的選擇。因為VP7決定病毒的G血清型，Coulson B S等［24］經序列分析比較發(fā)現(xiàn)，VP7氨基酸序列中存在6個高變區(qū)（A～F）。Green K等的研究確定了VP7氨基酸序列中存在9個高變區(qū)（VR1～VR9）［25］，這些高變區(qū)與中和抗原決定簇位點的形成關系密切，以上的研究結果均表明，VP7基因容易發(fā)生變異，從而形成新的血清型，造成輪狀病毒性腹瀉的反復流行。因此，若針對VP7基因設計引物，只能檢測同一血清型的輪狀病毒，而目前在人和動物中間流行的輪狀病毒往往不是單一的血清型，這就給輪狀病毒的檢測增加了難度。而且從基因序列來看，VP7基因重疊序列較多，給引物設計造成了極大的困難，本實驗室亦嘗試過針對PoRV OSU株的VP7基因序列設計特異性引物，但是均得不到理想的PCR擴增產物，因此改用在A組RV中高度保守的VP6作為檢測的靶標，而且考慮到VP6在病毒感染的早期就開始合成，參與病毒粒子的組裝，因此更適合A組輪狀病毒早期感染的檢測。

本試驗以SYBR GreenⅠ作為熒光染料，以RV保守序列VP6基因為擴增靶標，建立了檢測A組豬輪狀病毒的熒光定量PCR方法。該方法對豬輪狀病毒具有很好的特異性，在1.0×102～1.0×109拷貝／μL范圍內具有很好的線性關系（R2＝0.999），擴增效率為95.7%，最低檢測病毒拷貝數為1.0×101拷貝／μL，比普通RT－PCR敏感性高出2個數量級，并且重復性良好，批內和批間變異系數均小于2%，說明該方法具備很好的穩(wěn)定性。更重要的是，本試驗首次檢測了PoRV OSU株在永生化豬小腸上皮細胞（SIEC）中的增殖情況。目前Po RV致病機理的研究一直沒有很大的突破，主要原因就是缺少理想的靶細胞。研究人輪狀病毒致病機理所用的細胞系主要有恒河猴腎細胞系MA104、人結腸腺癌細胞系Caco－2和人結腸癌細胞系 HT－29，而Po RV主要侵害豬的小腸上皮細胞，用上述細胞研究PoRV的致病機理說服力不夠強，我們用豬輪狀病毒OSU株感染永生化豬小腸黏膜上皮細胞（SIEC），用熒光定量PCR方法對感染了PoRV 24、48、72 h的SIEC內以及上清液中的病毒含量進行了定量檢測，結果表明所建立的實時熒光定量PCR方法可用于A組Po RV早期感染的診斷和定量分析及流行病學監(jiān)測，更為重要的是，本試驗表明PoRV可以很好地在SIEC中增殖，因此SIEC可以作為下一步開展Po RV致病機理研究較為理想的細胞材料。

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