高速逆流色譜分離純化凍青中的黃酮類化合物

高 冷，謝冠男，劉 達(dá)，吳洪發(fā)

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012)

凍青學(xué)名槲寄生[Viscumcoloratum(Kom.) Nakai]，雙子葉植物綱，常綠半寄生小灌木，其主產(chǎn)區(qū)在東北，常寄生在楊樹、柳樹、榆樹上[1]。凍青的主要活性成分有黃酮類化合物[2]、槲寄生凝集素[3]、毒素、生物堿、有機(jī)酸及木脂素等[4,5]。其中黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗衰老、降壓、降血脂、提高機(jī)體免疫力等藥理活性[6,7]。目前，采用高效液相色譜法(HPLC)尚無法大量分離出凍青中一種或多種活性成分。

高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一種高效快速的液-液分離技術(shù)，是將處于高速動態(tài)平衡且互不混溶的兩相溶劑中的樣品按不同的分配比將組分分離。由于不需要固相載體作固定相，避免了樣品的不可逆吸附、損失和污染[8]，同時(shí)該技術(shù)具備良好的重現(xiàn)性，可同步完成制備、分離、純化過程，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的分離制備及中藥的分析鑒定[9～11]。

作者以長白山區(qū)凍青為原料，采用超聲波輔助浸提其中的黃酮類化合物，并首次采用HSCCC和大孔吸附樹脂相結(jié)合對其進(jìn)行分離純化，可為中草藥中活性成分的分離純化和制備提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

凍青，2009年11月采自長白山地區(qū)，經(jīng)鑒定為Viscumcoloratum(Kom.) Nakai。

AB-8大孔吸附樹脂，安徽三星樹脂有限公司；乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲醇，分析純，北京化工廠；甲醇，色譜純，天津康科德科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

LGJ-30型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；GL-21LM型離心機(jī)，星科科學(xué)儀器有限公司；SCIENT2-HF2000型超聲波循環(huán)提取機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent-1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；TBE-300型高速逆流色譜儀，上海同田生化技術(shù)有限公司；Mercury plus 400型核磁共振儀，美國Varian公司。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

取50 g干燥的凍青莖粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，用乙醚索氏提取去除油脂以及色素等脂溶性雜質(zhì)，棄去溶液，回收原料，干燥揮發(fā)除去原料中的乙醚；再用60%乙醇溶液按料液比1∶15，超聲提取20 min，將粗提液濃縮，冷凍干燥得凍青粗提物1.26 g。

1.2.2 大孔吸附樹脂除雜

凍青粗提物用蒸餾水溶解，離心去除不溶物，上清液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱吸附，先用3 BV的蒸餾水洗脫，再用3 BV的60%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得凍青粗提黃酮，進(jìn)行HPLC檢測，選擇其中主要組分作為HSCCC目標(biāo)分離物。

1.2.3 溶劑體系的選擇

依據(jù)文獻(xiàn)[12]用HPLC測定樣品在不同溶劑體系[正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶4∶5∶3，體積比，下同)、乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3)、氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶2∶2∶1)]中的分配系數(shù)。稱取1 mg凍青粗提黃酮置于5 mL試管中，分別加入已經(jīng)達(dá)到平衡的上、下相溶劑各1 mL，振蕩使樣品充分溶解，靜置平衡，然后上下相各取0.2 mL，離心濃縮干燥，接著用甲醇溶解，進(jìn)行HPLC檢測，并計(jì)算分配系數(shù)，據(jù)此選擇適宜的溶劑體系。分配系數(shù)依下式計(jì)算：

式中：A1、A2分別為上、下相中化合物的峰面積。

1.2.4 HSCCC分離純化

按比例配制選定溶劑體系，放入分液漏斗中靜置分層，分層時(shí)間為50 s，上相為固定相，下相為流動相，螺旋管柱正轉(zhuǎn)800 r·min-1，流動相流速3 mL·min-1，進(jìn)樣量20 mL，進(jìn)樣濃度20 mg·mL-1，檢測波長254 nm。手動收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得到淡黃色化合物Ⅰ和白色化合物Ⅱ。

1.3 分析測試

采用高效液相色譜分析凍青粗提物、凍青粗提黃酮、化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。色譜條件為：Kromasil KR006-C18不銹鋼色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(60∶40)，流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫28 ℃，檢測波長254 nm。

采用核磁共振(1HNMR、13CNMR)對化合物Ⅰ和化合物Ⅱ進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。樣品以氖代二甲基亞砜(DMSO-d6)溶解。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍青粗提物的HPLC分析(圖1)

圖1 凍青粗提物的HPLC圖譜

由圖1可知，凍青粗提物在10～25 min之間出峰較多，且16.305 min和22.870 min處的化合物的含量較高。另外，凍青粗提物含有大量的雜質(zhì)，需要進(jìn)一步分離純化。

2.2 凍青粗提黃酮的HPLC分析(圖2)

圖2 凍青粗提黃酮的HPLC圖譜

由圖2可以看出，經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化后得到的凍青粗提黃酮雜質(zhì)明顯減少，主要存在兩類化合物Ⅰ、Ⅱ，其出峰時(shí)間與凍青粗提物比較接近，分別為16.425 min、22.965 min。以化合物Ⅰ和Ⅱ?yàn)槟繕?biāo)分離物選擇溶劑體系進(jìn)行下一步HSCCC分離。

2.3 溶劑體系的選擇

凍青粗提黃酮在不同溶劑體系中的分配系數(shù)見表1。

表1 凍青粗提黃酮在不同溶劑體系中的分配系數(shù)

綜合考慮分配系數(shù)(表1)、固定相保留率、分離度和峰形，選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶4∶5∶3)作為適宜的溶劑體系用于HSCCC分離純化。

2.4 HSCCC分離純化結(jié)果

溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3∶4∶5∶3)，HSCCC分離凍青粗提黃酮中的化合物Ⅰ、Ⅱ，結(jié)果見圖3。

重復(fù)進(jìn)樣分離2次，分別收集圖3所示兩種化合物Ⅰ、Ⅱ流出液，進(jìn)行后續(xù)純度檢測。

圖3 凍青粗提黃酮的HSCCC分離圖譜

2.5 產(chǎn)物純度測定

將HSCCC分離所得的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ，用甲醇溶解后進(jìn)行HPLC測定，純度分別為98.01%和96.10%，HPLC圖譜見圖4。

2.6 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ的核磁共振數(shù)據(jù)：1HNMR(DMSO-d6)，δ,ppm：1.72(1H，s，-CO-CH3，C6″)，5.42(1H，d，J=8 Hz，1 Hz，β-葡萄糖基C1-H)，6.31(1H，d，J=2 Hz，C6-H)， 6.70(1H，d，J=2 Hz，C8-H)， 6.85(1H，d，J=8 Hz，C5′-H)，7.51(1H，dd，J=8 Hz，1.5 Hz，C6′-H，C6,8-H)， 7.78(1H， d，J=1.5 Hz，C2′-H)，9.73(1H，s，C4′-OH)，12.48(1H，s，C5′-OH)。13CNMR(DMSO-d6)，δ，ppm：156.9(C2)，133.8(C3)，177.8(C4)，160.8(C5)，93.3(C6)，165.5(C7)，92.6(C8)，156.6(C9)，105.4(C10)，121.5(C1′)，113.8(C2′)，149.8(C3′)，147.3(C4′)，115.6(C5′)，122.6(C6′)，56.5(OCH3)，56.2(OCH3)，101.3(C1″)，74.6(C2″)，77.5(C3″)，70.2(C4″)，76.6(C5″)，60.8(C6″)。以上數(shù)據(jù)與已知鼠李秦素-3-O-β-D-葡萄糖苷的核磁共振數(shù)據(jù)一致[13]。

圖4 化合物Ⅰ(a)和化合物Ⅱ(b)的HPLC圖譜

化合物Ⅱ的核磁共振數(shù)據(jù)：1HNMR(DMSO-d6)，δ,ppm：2.76(1H，dd，J=4 Hz，12 Hz，C3，cis-H)，3.23～3.47(m，糖分子中H，OH峰及C3，trans-H)，5.04(H，m，β-葡萄糖基C1-H)，3.79(3H，s，C3′-OCH3),5.49(1H，dd，J=4 Hz，1 Hz，C2-H)，6.17(2H，s，C6,8-H)，6.90(1H，d，J=8.5 Hz，1 Hz，C5′-H)，6.92(1H，dd，J=8.5 Hz，2 Hz，C6′-H)，7.11(1H，d，J=2 Hz，C2′-H)，9.18(1H，s，C4′-OH)，12.07(1H，s，C5-OH)。13CNMR(DMSO-d6)，δ,ppm：79.1(C2)，42.3(C3)，197.4(C4)，163.1(C5)，96.7(C6)，165.5(C7)，95.9(C8)，162.9(C9)，103.4(C10)，129.3(C1′)，111.4(C2′)，147.7(C3′)，147.2(C4′)，115.6(C5′)，120.1(C6′)，56.0(OCH3)，99.9(C1″)，73.2(C2″)，77.2(C3″)，69.7(C4″)，76.4(C5″)，60.8(C6″)。以上數(shù)據(jù)與已知高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的核磁共振數(shù)據(jù)一致[14]。

3 結(jié)論

采用高速逆流色譜和大孔吸附樹脂相結(jié)合的方法，從凍青中分離出兩種高純度黃酮類化合物，純度分別為98.01%、96.10%，經(jīng)HPLC和NMR鑒定為鼠李秦素-3-O-β-D-葡萄糖苷和高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。采用HSCCC技術(shù)分離中草藥有效成分可以達(dá)到較高的純度和產(chǎn)率，制備量大、效率高，優(yōu)勢獨(dú)特，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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