低營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)絮菌Rheinheimera aquimaris P6的分離篩選及其絮凝特性研究

劉春爽，趙東風(fēng)，國(guó)亞?wèn)|，蔡 蕓，張?jiān)撇?/p>

(中國(guó)石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266555)

生物絮凝劑作為一種安全、高效、無(wú)二次污染、易生物降解的新型藥劑，在水處理領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[1]，但存在生產(chǎn)成本高、用量大的缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用[2]。因此，分離篩選高效的產(chǎn)絮菌種成為降低生物絮凝劑生產(chǎn)成本的重要途徑。

目前，人們已分離篩選出多種產(chǎn)絮菌，如Bacillussp. F19[3]、ProteusmirabilisTJ-1[4]、Bacillusfirmus[5]等均具有較高的產(chǎn)絮能力，所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率在90%以上。然而，這些產(chǎn)絮菌的產(chǎn)絮條件大都為富營(yíng)養(yǎng)條件，如Bacillussp.F19所需底物為20 g·L-1蔗糖、2.5 g·L-1酵母膏；ProteusmirabilisTJ-1所需底物為10 g·L-1葡萄糖、1.0 g·L-1蛋白胨；Bacillusfirmus所需底物為20 g·L-1葡萄糖、5.0 g·L-1蛋白胨，這無(wú)形中增加了生物絮凝劑的生產(chǎn)成本。若能分離篩選低營(yíng)養(yǎng)條件下的高效產(chǎn)絮菌，優(yōu)化其產(chǎn)絮條件，從源頭降低絮凝劑生產(chǎn)成本，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)生物絮凝劑的工業(yè)化應(yīng)用具有非常重大的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

基于此，作用采用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從海洋底泥中分離篩選高效產(chǎn)絮菌株，優(yōu)化產(chǎn)絮條件，并通過(guò)紫外光譜、蛋白和糖顯色反應(yīng)、紅外光譜等手段分析低營(yíng)養(yǎng)條件下所得絮凝劑的組成及結(jié)構(gòu)特征，擬為降低生物絮凝劑的生產(chǎn)成本提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 產(chǎn)絮菌的分離篩選

采用平板劃線分離法，以海洋底泥為接種物、以低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，經(jīng)多次純化后得到高效產(chǎn)絮菌。

低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g·L-1，淀粉0.5 g·L-1，酵母膏0.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，酪蛋白0.5 g·L-1，K2HPO40.3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH值7.6。

1.2 生物絮凝劑樣品的制備

將制取的生物絮凝劑發(fā)酵液在12 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min。取上清液濃縮至體積減半，加入3 BV 4 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，振蕩至出現(xiàn)白色絮體。常溫、5000 r·min-1離心15 min，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，溶于少量蒸餾水中，加入3 BV 4 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，振蕩后于5000 r·min-1、常溫離心15 min，反復(fù)2次，將沉淀于40 ℃真空干燥得生物絮凝劑樣品。

1.3 絮凝效果的測(cè)定

絮凝效果采用高嶺土評(píng)價(jià)方法[6]測(cè)定，用絮凝率(μ)表征:

式中：A為空白水樣上清液的濁度；B為待測(cè)水樣上清液的濁度。

1.4 分析檢測(cè)

生物絮凝劑的紫外光譜分析、蛋白和糖顯色反應(yīng)分析參照文獻(xiàn)[7,8]。

生物絮凝劑的紅外光譜分析：取1 mg生物絮凝劑樣品與150 mg KBr粉末放入瑪瑙研缽中在紅外燈下輕輕研磨，經(jīng)壓片機(jī)壓成薄片，上機(jī)測(cè)定，在500～4000 cm-1掃描。

水中油含量：采用萃取-紅外分光光度法(GB/T 16488-1996)[9]測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)絮菌的分離篩選

采用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)多次稀釋平板分離和平板劃線純化，從海洋底泥中篩選出絮凝率在80%以上的菌株7株，其中一株命名為P6的菌株菌落特征為橙黃色、圓形、光滑，發(fā)酵液特別粘稠，絮凝效果較好，絮凝率在85%左右。因此，選擇此菌株進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，研究其發(fā)酵產(chǎn)絮特性。該菌為球狀，革蘭氏陰性，屬好氧細(xì)菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將16S rDNA測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)里的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Rheinheimeraaquimaris相似度最高，達(dá)99%。因此，P6菌株和其所產(chǎn)絮凝劑被分別命名為RheinheimeraaquimarisP6和 MBF-P6。

2.2 影響Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮的關(guān)鍵因素

2.2.1 培養(yǎng)基組成

不同的碳源和氮源對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮能力有不同的影響。分別以葡萄糖、淀粉、蔗糖、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、果糖、乳糖、木糖、乙醇作為碳源，以尿素、NH4Cl、NaNO3、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白作為氮源，經(jīng)相同條件發(fā)酵后，測(cè)定絮凝率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源(a)和氮源(b)對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

由圖1可看出，價(jià)格低廉的葡萄糖作為碳源、尿素作為氮源時(shí)所產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果最好。

碳氮比對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 碳氮比對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

由圖2可看出，碳氮比為1∶1時(shí)，RheinheimeraaquimarisP6的絮凝率最高，產(chǎn)絮效果最好；碳氮比高于或低于1∶1都會(huì)導(dǎo)致絮凝效果變差。由圖2還可看出，當(dāng)碳氮比為5∶1(葡萄糖10 g·L-1,尿素2 g·L-1)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最好，但絮凝效果較差。

RheinheimeraaquimarisP6在含有1.5 g·L-1葡萄糖和1.5 g·L-1尿素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后絮凝率達(dá)到最高，為87.32%。與現(xiàn)有產(chǎn)絮菌Bacillussp.F19[3]、ProteusmirabilisTJ-1[4]、Bacillusfirmus[5]相比，RheinheimeraaquimarisP6的產(chǎn)絮成本(培養(yǎng)基費(fèi)用)降低50%～80%。

2.2.2 初始pH值

以1.5 g·L-1葡萄糖作為碳源、1.5 g·L-1尿素作為氮源，調(diào)整初始pH值為3～10，考察其對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 初始pH值對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

由圖3可看出，培養(yǎng)基初始pH值為4～9時(shí)，發(fā)酵液的絮凝率均在85%以上；當(dāng)pH值為7時(shí)，絮凝率達(dá)到最高，為89.39%；過(guò)低或過(guò)高的pH值均對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮有抑制作用。表明RheinheimeraaquimarisP6對(duì)環(huán)境中pH值要求不嚴(yán)格，易于培養(yǎng)。

2.2.3 金屬離子

0.2 g·L-1的Ca2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Al3+、Zn2+、Cu2+對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 金屬離子對(duì)Rheinheimera aquimaris P6產(chǎn)絮效果的影響

由圖4可看出，不同的金屬離子對(duì)RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮效果的影響不同。Mg2+、Fe2+對(duì)菌株RheinheimeraaquimarisP6產(chǎn)絮能力有促進(jìn)作用，而Mn2+、Zn2+、Cu2+則有明顯的抑制作用。這可能是由于，Mg2+是構(gòu)成細(xì)菌體內(nèi)某些酶的活性成分，并對(duì)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)如核糖體、細(xì)胞膜等的穩(wěn)定性起著重要作用，Mg2+的加入有助于促進(jìn)胞外聚合物中多糖的生成，從而增加絮凝劑產(chǎn)量[10];Fe2+是微生物生長(zhǎng)所必需的元素，是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性基及鐵卟啉的組成部分，F(xiàn)e2+濃度適宜時(shí)，酶合成效果較好，從而使得絮凝劑產(chǎn)量明顯增加;而Mn2+、Zn2+、Cu2+是重金屬，對(duì)微生物具有毒害作用，抑制絮凝劑的產(chǎn)生。

2.2.4 最佳產(chǎn)絮效果

在1.5 g·L-1葡萄糖為碳源、1.5 g·L-1尿素為氮源、培養(yǎng)基初始pH值為7、投加0.2 g·L-1Fe2+的最佳培養(yǎng)條件下，RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率達(dá)到90.2%。可見(jiàn)RheinheimeraaquimarisP6是一株產(chǎn)絮性能穩(wěn)定的高效產(chǎn)絮菌株。

2.3 生物絮凝劑的組成及結(jié)構(gòu)特征

提取RheinheimeraaquimarisP6發(fā)酵液粗產(chǎn)品，在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，紫外掃描曲線在260 nm處無(wú)吸收峰,但在280 nm和200 nm處有吸收峰，這說(shuō)明絮凝劑中幾乎不含核酸，但含有蛋白質(zhì)和糖類。因此可以定性判斷該絮凝劑的有效成分是蛋白質(zhì)和糖類。

經(jīng)茚三酮、蒽酮等顯色劑進(jìn)行生化反應(yīng)分析，進(jìn)一步確定RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑中含有蛋白質(zhì)和多糖。

生物絮凝劑樣品的紅外光譜見(jiàn)圖5。

圖5 Rheinheimera aquimaris P6所產(chǎn)生物絮凝劑的紅外光譜

由圖5可看出，3414.46 cm-1處寬而強(qiáng)的特征吸收峰是由O-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的，可知該絮凝劑結(jié)構(gòu)中必然含有大量的-OH；2960.87 cm-1和2930.73 cm-1處的2個(gè)吸收峰是由飽和C-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的，并且同時(shí)存在-CH3和-CH2-；1700～1600 cm-1間的強(qiáng)吸收峰是由C=O鍵伸縮振動(dòng)引起的；1000 cm-1附近出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是由C-O鍵伸縮振動(dòng)引起的，由此可判定該絮凝劑結(jié)構(gòu)中存在-COOH；1026.09 cm-1和1069.82 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)吸收峰，判斷還存在另外一種C-O鍵，應(yīng)為C-O-C中的C-O鍵伸縮振動(dòng)引起的。因此，可以確定RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑的活性成分中含有多糖物質(zhì)。

用考馬斯亮蘭、蒽酮法測(cè)定發(fā)酵液粗產(chǎn)品中多糖和蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑含47.9%蛋白質(zhì)、47.3%糖，約為1∶1。

3 結(jié)論

(1)利用低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從海洋底泥中篩選到一株高效產(chǎn)絮菌株P(guān)6，經(jīng)16S rDNA鑒定其為Rheinheimeraaquimaris菌屬。

(2)RheinheimeraaquimarisP6 產(chǎn)絮最適碳氮源為1.5 g·L-1葡萄糖和1.5 g·L-1尿素，最佳初始發(fā)酵pH值為7，在添加0.2 g·L-1Fe2+的條件下，所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率達(dá)90.2%，與現(xiàn)有產(chǎn)絮菌株相比，絮凝劑生產(chǎn)成本降低50%～80%。

(3)菌株RheinheimeraaquimarisP6所產(chǎn)絮凝劑含有-OH、C-H、C-O和C=O鍵，由蛋白質(zhì)和多糖組成，含量分別為47.9%、47.3%，蛋白質(zhì)和多糖比例約為1∶1。

(4)本研究為從源頭降低絮凝劑生產(chǎn)成本、推動(dòng)我國(guó)生物絮凝劑的工業(yè)化應(yīng)用提供了重要的信息。

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