海洋來源真菌Hypocrea virens菌絲體的化學(xué)成分研究

劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會明

(1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110001；2.沈陽藥科大學(xué) 創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110016；3.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；4.青島科技大學(xué)，山東 青島 266042)

自20世紀(jì)70年代以來，海洋微生物作為一種新藥篩選資源，因其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)獨特、活性顯著、易于工業(yè)化操作等優(yōu)勢而倍受關(guān)注[1]，尤其是在抗腫瘤藥物領(lǐng)域有著巨大潛力[2]。

為了尋找新的抗腫瘤活性成分，作者對海洋來源真菌Hypocreavirens的菌絲體進(jìn)行了化學(xué)成分研究，共分離得到8個化合物，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

1 實驗

1.1 菌株

實驗菌株于2007年12月采自廣西沙田潮間帶正紅樹(Rhizophoraapiculata)。由國家海洋局第一海洋研究所、青島科技大學(xué)田黎教授鑒定為真菌Hypocreavirens。菌株保存編號：HTTA-Z07723，存放于科技部資助的國家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫。

1.2 試劑與儀器

實驗所用試劑為分析純或色譜純。

開放ODS柱色譜填料(100 μm),日本YMC公司；Sephadex LH-20，GE healthcare；柱色譜硅膠(200～300目)及薄層色譜硅膠，青島海洋化工廠；Bruker ARX-300型和AV-600型核磁共振儀；L2130型HPLC(檢測器為L2400型)，日本HITACHI公司；YMC-Pack ODS-AM:10 mm×250 mm。

1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：燕麥浸汁200 mL，蛋白胨3 g，酵母粉2 g，葡萄糖12 g，NaCl 15 g，MgCl2· 6H2O 1.0 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，水1000 mL。

1.4 提取分離

取菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于25℃、15 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 d，發(fā)酵量60 L。

發(fā)酵液經(jīng)過濾得菌絲體243 g(干重)。菌絲體經(jīng)反復(fù)“冷凍-融化”處理后，用4 BV丙酮提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收溶劑得浸膏97 g。

菌絲體丙酮提取物經(jīng)硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，得到219個流分(每流分800 mL)。

第5流分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅲ(5 mg)；第4～11流分合并，經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(40∶1～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫。第12亞流分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅱ(2 mg)。第58～59亞流分合并，經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅵ(5 mg)。第67～72亞流分合并，經(jīng)開放ODS柱色譜及HPLC進(jìn)一步處理得到化合物Ⅰ(2 mg)。第84～87亞流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到化合物Ⅴ(3 mg)。第27～31流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜及開放ODS柱色譜得到化合物Ⅳ(6 mg)。第39～43流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到第14～16亞流分，經(jīng)開放ODS、Sephadex LH-20及硅膠柱色譜得到化合物Ⅷ(3 mg)。第51～60流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到第22～28亞流分，經(jīng)開放ODS及硅膠柱色譜得到化合物Ⅶ(4 mg)。

2 結(jié)果與討論

化合物Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)見表1、化合物Ⅲ～Ⅷ的13CNMR數(shù)據(jù)見表2。

化合物Ⅰ：白色無定形粉末。1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ,ppm：2.31(3H，s)，1.08(3H，d，J=6.6 Hz)，0.93(3H，d，J=6.8 Hz)，0.86(3H，d，J=7.0 Hz)，0.82(3H，d，J=7.0 Hz)，0.48(3H，s)，共6個甲基，提示該化合物可能為麥角甾類。其中2.31(3H，s)不同于一般麥角甾的角甲基，處于較低場，推測為連接在芳環(huán)或羰基上的甲基。5.20(1H，m)、5.24(1H，m)應(yīng)為側(cè)鏈22、23位雙鍵上的質(zhì)子信號。6.65(1H，s)推測為芳?xì)湫盘枴?3CNMR(150 MHz,CDCl3)，δ,ppm：138.4，136.2，135.5，135.2，133.9，132.4，131.2，124.0，共8個sp2雜化碳信號，其中135.5、132.4為側(cè)鏈22、23位雙鍵上特征的碳信號。剩余6個碳信號中有5個季碳，推測為芳環(huán)的結(jié)構(gòu)，在普通麥角甾骨架中無法得到滿足，因此推測該化合物可能為變形的麥角甾類化合物。根據(jù)H-12(δH1.71，m和δH2.72，dd，J=8.2 Hz，13.2 Hz)與C-11(δ67.6)、C-9(δ133.9)、C-13(δ45.2)之間的HMBC相關(guān)確定了OH-11的取代位置。根據(jù)H-1(δH2.82，m；2.90，m)和H-2(δH1.77，m；2.01，m)之間的1H-1H COSY相關(guān)，H-3(δH4.21，m)和H-2(δH1.77，m)、H-4(δH3.03，dd)之間的1H-1H COSY相關(guān)，以及NOESY譜中H-4(δH3.03，dd)與CH3-19(δH2.31，s)之間存在的相關(guān)，確定OH-3的取代位置，見圖1。

根據(jù)H-4的偶合常數(shù)(J=16.8 Hz，8.1 Hz，J=16.8 Hz，5.0 Hz)，推測H-3處于直立鍵(通過搭建分子模型判斷并結(jié)合生物合成來源)，因此OH-3為α構(gòu)型。H-11(δH5.15，m)與CH3-18(δH0.48，s)的NOESY相關(guān)，表明H-11為β取向，則OH-11為α構(gòu)型。結(jié)合以上信息并參照文獻(xiàn)[3]，鑒定化合物Ⅰ為1(10→6)Abeo-(22E，24R)-ergosta-5，7，9，22-tetraene-3α，11α-diol，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

表1 化合物Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)

圖1 化合物Ⅰ的重要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)(a)、NOESY(b)相關(guān)

化合物Ⅱ：無色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，UV 365 nm下有微弱淡藍(lán)色熒光，10% 硫酸乙醇顯紫紅色(顯色后UV 365 nm下呈粉紅色熒光)。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:4.73(1H，br s，H-28a)，4.67(1H，d，J=1.2 Hz，H-28b)，3.24(1H，dd，J=4.8 Hz，11.4 Hz，H-3)，1.04(3H，d，J=6.9 Hz，H-26 or H-27)，1.03(3H，d，J=6.9 Hz，H-27 or H-26)，1.01(3H，s，H-29)，0.99(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J=6.3 Hz，H-21)，0.89(3H，s，H-31)，0.82(3H，s，H-30)，0.70(3H，s，H-18)。13CNMR(150 MHz，CDCl3)，δ,ppm:156.9(C-24)，134.4(C-8 and C-9)，105.9(C-28)，79.0(C-3)，50.4(C-17 and C-5)，49.8(C-14)，44.5(C-13)，38.9(C-4)，37.0(C-10)，36.5(C-20)，35.6(C-1)， 35.0(C-22)， 33.8(C-25)，31.3(C-23)，31.0(C-12)，30.8(C-15)，28.2(C-16)，27.9(C-29)，27.8(C-2)，26.5(C-7)，24.3(C-31)，22.0(C-26)，21.9(C-27)，21.0(C-11)，19.1(C-19)，18.7(C-21)，18.2(C-6)，15.7(C-18)，15.4(C-30)。結(jié)合以上信息并參照文獻(xiàn)[4]，鑒定化合物Ⅱ為24-甲烯基羊毛脂烷-8-烯-3β-醇(24-Methylenelanostane-8-ene-3β-ol)，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2 化合物Ⅰ～Ⅷ的結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅲ：無色針狀結(jié)晶(乙酸乙酯)，UV 254 nm呈明顯暗斑，10% 硫酸乙醇顯紫黑色。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:5.59(1H，dd，J=5.7 Hz，2.6 Hz，H-6)，5.41(1H，m，H-7)，5.24(1H，dd，J=15.7 Hz，6.9 Hz，H-23)，5.16(1H，dd，J=15.7 Hz，6.9 Hz，H-22)，3.65(1H，m，H-3)，2.47(1H，ddd，J=11.7 Hz，4.5 Hz，2.2 Hz，H-4b)，2.29(1H，t，J=11.7 Hz，H-4a)，1.06(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.62(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。與對照品共薄層，并與文獻(xiàn)[5]中數(shù)據(jù)對照基本一致,鑒定化合物Ⅲ為(22E，24R)-麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇[(22E，24R)-Ergosta-5，7，22-triene-3β-ol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅳ：無色針狀結(jié)晶(甲醇)，10% 硫酸乙醇顯墨綠色。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:5.20(2H，m，H-22，23)，4.23(1H，br s，H-6)，3.94(1H，m，H-3)，3.31(1H，m，H-7)，1.14(3H，s，H-19)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.91(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.3 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=6.3 Hz，H-26)，0.59(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。與文獻(xiàn)[6]中數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物Ⅳ為(22E，24R)-麥角甾-8，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇[(22E，24R)-Ergosta-8，22-diene-3β，5α，6β，7α-tetraol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

表2 化合物Ⅲ～Ⅷ的13CNMR數(shù)據(jù)

化合物Ⅴ：無色粒狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，10% 硫酸乙醇顯褐色(顯色后UV 365 nm下呈黃褐色熒光)。1HNMR(300 MHz，C5D5N)，δ,ppm:5.82(1H，m，H-7)，5.25(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-23)，5.16(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-22)，4.49(1H，m，H-6)，4.25(1H，br s，H-3)，1.58(3H，s，H-19)，1.03(3H，d，J=6.3 Hz，H-21)，0.95(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26),0.68(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。結(jié)合以上信息并參照文獻(xiàn)[7]，鑒定化合物Ⅴ為5α，9α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，6β-二醇[5α，9α-Epidioxy-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，6β-diol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅵ：無色針晶(乙酸乙酯)，10% 硫酸乙醇顯墨綠色。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:6.51(1H，d，J=8.6 Hz，H-7)，6.23(1H，d，J=8.6 Hz，H-6)，5.21(1H，dd，J=15.5 Hz，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，dd，J=15.5 Hz，7.8 Hz，H-23)，3.98(1H，m，H-3)，1.00(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-28)，0.87(3H，s，H-19)，0.83(3H，d，J=6.5 Hz，H-27)，0.82(3H，s，H-18)，0.81(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)。13CNMR數(shù)據(jù)見表2。與對照品共薄層，并與文獻(xiàn)[8]中數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物Ⅵ為5α，8α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇[5α，8α-Epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-diene-3β-ol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅶ：無色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，10% 硫酸乙醇顯墨綠色(未加熱)，加熱后顯紫紅色。1HNMR(300 MHz，C5D5N),δ,ppm:5.74(1H，m，H-7)，5.26(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-22)，5.18(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-23)，4.83(1H，m，H-6)，4.32(1H，m，H-3)，1.54(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.4 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.4 Hz，H-26)，0.66(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)與對照品共薄層，并參照文獻(xiàn)[9],鑒定化合物Ⅶ為(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇[(22E，24R)-Ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅷ：白色無定形粉末，10% 硫酸乙醇顯黃褐色。1HNMR(300 MHz，C5D5N),δ,ppm:8.62(1H，s，5-OH)，6.27(2H，br s，3，9-OH)，5.93(1H，d，J=2.1 Hz，H-7)，5.27(1H，dd，J=15.2 Hz，7.3 Hz，H-23)，5.18(1H，dd，J=15.2 Hz，7.3 Hz，H-22)，4.63(1H，m，H-3)，1.15(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.64(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)與對照品共薄層，并參照文獻(xiàn)[10],鑒定化合物Ⅷ為3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮[3β，5α，9α-Trihydroxy-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

3 結(jié)論

從海洋來源真菌Hypocreavirens的菌絲體中共分離得到8個化合物，分別為1(10→6)Abeo-(22E，24R)-ergosta-5，7，9，22-tetraene-3α，11α-diol(Ⅰ)、24-甲烯基羊毛脂烷-8-烯-3β-醇(Ⅱ)、(22E，24R)-麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇(Ⅲ)、(22E，24R)-麥角甾-8，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(Ⅳ)、5α，9α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，6β-二醇(Ⅴ)、5α，8α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇(Ⅵ)、(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(Ⅶ)、3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮(Ⅷ)。其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ均為首次從該屬真菌中分離得到，化合物Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ為首次從該種真菌中分離得到。

參考文獻(xiàn)：

[1] 閻莉萍,洪葵.海洋微生物合成的抗腫瘤活性物質(zhì)[J].國外醫(yī)藥(抗生素分冊)，2003，24(5):213-217.

[2] Flam F.Chemical prospectors scour the seas for promising drugs[J].Science，1994，266(5189):1324-1325.

[3] Luo X，Li F，Shinde P B,et al.26，27-Cyclosterols and other polyoxygenated sterols from a marine spongeTopsentiasp.[J].Journal of Natural Products，2006，69(12):1760-1768.

[4] Shirane N，Murabayashi A，Masuko M，et al.Effect on ergosterol biosynthesis of a fungicide，SSF-109，inBotrytiscinerea[J].Phytochemistry，1990，29(8):2513-2520.

[5] Shirane N，Takenaka H，Ueda K，et al.Sterol analysis of DMI-resistant and sensitive strains ofVenturiainaequalis[J].Phytochemistry，1996，41(5):1301-1308.

[6] Li H J，Lin Y C，Vrijmoed L L P，et al.A new cytotoxic sterol produced by an endophytic fungus fromCastaniopsisfissaat the south China sea coast[J].Chinese Chemical Letters，2004，15(4):419-422.

[7] Yaoita Y，Matsuki K，Iijima T,et al.New sterols and triterpenoids from four edible mushrooms[J].Chem Pharm Bull,2001，49(5):589-594.

[8] 湯海峰，易楊華，姚新生，等.褐藻鐵釘菜中的甾醇成分[J].中國海洋藥物，2002，21(1):1-4.

[9] 李國友，李伯剛，劉光曄，等.赭曲霉43的甾醇成分研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2005，11(1):67-70.

[10] Yaoita Y，Amemiya K，Ohnuma H,et al.Sterol constituents from five edible mushrooms[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1998，46(6):944-950.