薄層等電聚焦-X-射線熒光光譜法測定鐵超載小鼠肝中鐵含量分布

張 燕，劉家琴，高中洪

(1.西華大學(xué)物理與化學(xué)學(xué)院,四川 成都 610039；2.華中科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430074)

鐵是人體必需的微量元素之一，對維持人體正常機(jī)能起著十分重要的作用[1，2]。但是長期以來，人們只注意到鐵營養(yǎng)價(jià)值的一面，而忽略了鐵過量的潛在危害。鐵超載(Iron overload)，或者稱為鐵負(fù)荷，是指由于遺傳因素或病理?xiàng)l件下鐵攝入過多，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列病理變化，特別是肝、腎損傷。鐵超載常見于過度輸血、血紅蛋白合成障礙、膳食結(jié)構(gòu)改變等，特別是后者逐漸受到許多學(xué)者的重視。人可因大量食用鐵強(qiáng)化食品或紅肉(血紅素鐵)、超量服用維生素C或某些含鐵多的藥物(尤其是補(bǔ)藥)、使用鐵制炊具、長期飲酒(紅酒中含鐵較多)等，導(dǎo)致體內(nèi)鐵超載[3]。研究發(fā)現(xiàn)，過多的鐵會損傷細(xì)胞，引發(fā)遺傳血色病[4，5]、神經(jīng)退行性疾病[6]、心血管疾病[7]及糖尿病等[8,9]。

薄層等電聚焦(Thin-layer isoelectric focusing)是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，其基本原理是利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH值梯度中進(jìn)行蛋白的分離分析[10]。X-射線熒光光譜法(X-Ray fluorescence spectrometry，XRF)是常用的非破壞性元素定性和定量分析技術(shù)，分析范圍廣、操作便捷，可用來測量性質(zhì)差別很大的樣品，不受元素價(jià)態(tài)以及試樣形狀和大小限制，且不要求或只要求做極少量樣品準(zhǔn)備工作。如Sz?kefalvi-Nagy等[11,12]用電泳分離鐵-硫蛋白及含F(xiàn)e、Ni的氫化酶后，采用質(zhì)子激光X-射線熒光法直接測定蛋白條帶中Fe、Ni的含量。高愈希等[13]采用電泳和同步X-射線熒光法分析了人肝細(xì)胞胞質(zhì)溶液中金屬蛋白的分布。陳春英等[14,15]也采用同樣的方法分析了金屬硫蛋白在不同組織中的分布。

鐵超載后，鐵在肝中大量聚積[16]。因肝中各個(gè)亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的不同，可以推測鐵超載后各亞細(xì)胞器中鐵含量的增加將有所差異。目前，關(guān)于鐵超載后蛋白鐵在體內(nèi)主要臟器中的分布和定位方面的研究還很少報(bào)道。

作者在此采用薄層等電聚焦和X-射線熒光光譜法分析鐵超載后，小鼠肝中各個(gè)亞細(xì)胞器中鐵含量的分布，以進(jìn)一步探究鐵超載導(dǎo)致機(jī)體損傷的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 動(dòng)物分組、飼養(yǎng)及處理

昆明種小鼠，清潔級，體重(20.6±0.5) g左右，雄性，購自湖北省衛(wèi)生防疫站。小鼠隨機(jī)分為2組，每組4只，分別為陰性對照組和陽性對照組。2組均給以正常飼料，正常飲水。陽性對照組隔1 d按100 mg·(kg bw)-1腹腔注射濃度為20 mg·mL-1的右旋糖苷鐵，共注射5次，右旋糖苷鐵總注射量為500 mg·(kg bw)-1；而陰性對照組則注射同量的生理鹽水。最后一次注射完后再喂養(yǎng)(室溫、正常光照及飲水)45 d后，于第46 d用戊巴比妥酸麻醉后迅速取出小鼠肝臟(處理前一晚禁食，正常飲水)，在冰冷的生理鹽水中洗凈余血，臟器用濾紙吸干，稱重。稱取部分組織，剪碎，然后和冰冷的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4，4 ℃)按1∶9的比例制成10%的組織勻漿。

1.2 肝胞液、線粒體、微粒體的制備

取10%的組織勻漿，用低溫低速離心機(jī)以1000～2000 r·min-1離心10 min，棄沉淀；上清液在低溫高速離心機(jī)上以8000～10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為肝胞液；沉淀用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，反復(fù)離心后沉淀即為線粒體；取肝胞液在低溫高速離心機(jī)上以105 000×g離心1 h，沉淀用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，重復(fù)離心后沉淀即為微粒體。

1.3 薄層等電聚焦分析

115 mm×85 mm×0.5 mm的5%聚丙烯酰胺凝膠(內(nèi)含5%的甘油以及2.4%的載體兩性電解質(zhì)，pH=3.0～9.5)。上樣量20 μL，且上樣靠近正極端。聚焦采用分步升壓方式：100 V，30 min；200 V，60 min；280 V，60 min。用表面電極測定凝膠沿電泳方向的pH值梯度分布。在凝膠上覆蓋一層玻璃紙，置潔凈干燥通風(fēng)處干燥。

1.4 X-射線熒光光譜分析

在中國科學(xué)院高能物理所核分析室的PW1830型X-光機(jī)上進(jìn)行。陽極電壓30 kV，電流強(qiáng)度40 mA，為鉬陽極靶。為了忽略樣品對入射X-射線吸收的影響，在X-光管出口處放置一定厚度的鋁箔以吸收低能X-射線。干膠板固定在樣品移動(dòng)臺上，選好位置后用1 cm×0.5 cm的光斑照射樣品。發(fā)出的X-射線由垂直于入射方向Si(Li)探測器探測，信號經(jīng)Ortec X-射線熒光光譜儀獲取輸出。沿電泳方向每隔1～2 mm取一個(gè)XRF譜。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用AXIL軟件，并用來源于空氣且含量恒定的Ar信號峰對其它信號峰進(jìn)行歸一化。用Mathematic軟件擬合各點(diǎn)，得到擬合曲線，并求出擬合曲線下面積，以信號峰面積表示相應(yīng)位置的金屬相對含量。將同一條帶內(nèi)各位置鐵信號峰面積對取譜位置作圖，曲線下總面積即代表該條帶內(nèi)的鐵含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 肝胞液中鐵含量分布(圖1)

a.薄層等電聚焦電泳條帶中各位置點(diǎn)的鐵含量分布 b.不同等電點(diǎn)所對應(yīng)的鐵含量分布

從圖1可以看出，肝胞液中共有3處鐵相對記數(shù)較高，分別位于正極端、距正極端34 mm處以及距正極端43 mm處，相應(yīng)的等電點(diǎn)分別為3.0、4.7和5.7。鐵超載后，3處的鐵含量均較正常顯著增加。

2.2 線粒體中鐵含量分布(圖2)

a.薄層等電聚焦電泳條帶中各位置點(diǎn)的鐵含量分布 b.不同等電點(diǎn)所對應(yīng)的鐵含量分布

從圖2可以看出，線粒體中含鐵蛋白主要分布在等電點(diǎn)5.7和7.0處。鐵超載后，2處的鐵含量均較正常顯著增加，且分布的范圍變寬。

2.3 微粒體中鐵含量分布(圖3)

a.薄層等電聚焦電泳條帶中各位置點(diǎn)的鐵含量分布 b.不同等電點(diǎn)所對應(yīng)的鐵含量分布

從圖3可以看出，微粒體同肝胞液一樣，也有3處鐵相對記數(shù)較高，分別位于正極端、距正極端27 mm處以及距正極端37 mm處，相應(yīng)的等電點(diǎn)分別為3.0、5.7和7.3。鐵超載后，等電點(diǎn)5.7處的鐵含量較正常顯著增加，其它兩處均無明顯變化。

2.4 討論

肝臟是體內(nèi)非常重要的臟器之一，具有多種生理功能，在碳水化合物、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)的代謝中都起著十分重要的作用。肝臟除了具有合成血清蛋白(如白蛋白、抗體、纖維蛋白素原)、尿素、凝血素以及其它凝血因子等功能外，還是一個(gè)解毒中心，可以清除內(nèi)源性或外源性的毒性物質(zhì)[17]。

生物組織中微量元素的研究不僅具有生物學(xué)意義，而且在臨床和病理學(xué)上也具有十分重要的作用。不同的病因?qū)е陆M織中微量元素新陳代謝的改變，從而形成不同物質(zhì)[17]。鐵超載可導(dǎo)致機(jī)體損傷，尤其是肝臟損傷。因此，研究鐵超載后肝臟中鐵蛋白的含量及分布對于認(rèn)識微量元素鐵過多產(chǎn)生的生物學(xué)意義很有幫助。生物樣品中金屬蛋白分布的研究方法一般是將樣品中的蛋白質(zhì)分離后測定其中的金屬含量[12]。但由于生物樣品的復(fù)雜性，研究生物樣品中金屬蛋白分布要求高效、高分辨率的蛋白質(zhì)分離方法以及高靈敏度的微量元素檢測方法，這也是本實(shí)驗(yàn)采用薄層等電聚焦-X-射線熒光光譜法分析鐵超載后小鼠各亞細(xì)胞器蛋白中鐵含量分布的原因。本實(shí)驗(yàn)將薄層等電聚焦凝膠進(jìn)行干燥處理后再進(jìn)行X-射線熒光分析，從而大大減弱了由凝膠材料所引起的光源康普頓散射。

肝臟是含鐵化合物進(jìn)行代謝和貯存的主要器官。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：鐵超載后，肝臟中鐵含量顯著增加，而且無論是肝胞液、線粒體還是微粒體，鐵含量均較正常組顯著增加。但3個(gè)亞細(xì)胞器鐵含量的增加量具有一定差異性，且存在如下關(guān)系：微粒體>肝胞液>線粒體。其原因可能是機(jī)體攝入的鐵被消化道吸收后，主要在肝細(xì)胞微粒體中進(jìn)行代謝而被肝細(xì)胞吸收。另外，肝胞液和微粒體正極端附近的鐵相對記數(shù)較高，這說明肝胞液和微粒體中存在某些帶有負(fù)電荷的含鐵蛋白，但具體形式還有待進(jìn)一步證實(shí)。肝胞液中另外還有2處鐵相對記數(shù)較高，其等電點(diǎn)分別為4.7和5.7，其中4.7與轉(zhuǎn)鐵蛋白的等電點(diǎn)一致，5.7與鐵蛋白的等電點(diǎn)一致。與肝胞液和線粒體相比較，盡管微粒體中含鐵蛋白也有3處分布，但鐵超載后，微粒體中含鐵量增加相對集中，增加的含鐵蛋白的等電點(diǎn)位于5.7處，這可能是因?yàn)殍F的貯存及代謝都主要發(fā)生在肝微粒體中的緣故。上述現(xiàn)象表明，鐵超載可導(dǎo)致肝胞液、線粒體和微粒體3個(gè)亞細(xì)胞器中鐵含量顯著增加，但因不同亞細(xì)胞器具有不同的生物學(xué)功能，所以3個(gè)亞細(xì)胞器的鐵含量分布也具有一定差異性。

3 結(jié)論

采用薄層等電聚焦-X-射線熒光光譜法對鐵超載小鼠肝中鐵含量的分布進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：機(jī)體攝入過量鐵，肝胞液、線粒體以及微粒體中鐵含量都較正常小鼠顯著增加，且增加的量存在如下關(guān)系：微粒體>肝胞液>線粒體；肝胞液中含鐵蛋白主要分布在等電點(diǎn)3.0、4.7和5.7處，線粒體中含鐵蛋白主要分布在等電點(diǎn)5.7和7.0處，微粒體含鐵蛋白主要分布在等電點(diǎn)3.0、5.7和7.3處；鐵超載后，肝胞液和線粒體各處鐵含量均顯著增加，而微粒體中所增加的鐵主要集中在等電點(diǎn)5.7處。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫祥瑞.必需微量元素的營養(yǎng)、生理及臨床意義[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1992:125-129.

[2] Papanikolaou G，Pantopoulos K.Iron metabolism and toxicity[J].Toxicol Appl Pharmacol，2005，202(2):199-211.

[3] Adams P C，Kertesz A E，Valberg L S.Clinical presentation of hemochromatosis:A changing scene[J].Am J Med，1991，90(4):445-449.

[4] Flynn D M，Mohan N，Mckiernan P，et al.Progress in treatment and outcome for children with neonatal haemochromatosis[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2003，88(2):124-127.

[5] Nieves-Santiago P，Cancel D，Canales D，et al.Presence of hemochromatosis-associated mutations in Hispanic patients with iron overlaod[J].P R Health Sci J，2011，30(3):135-138.

[6] Ponka P.Hereditary causes of disturbed iron homeostasis in the central nervous system[J].Ann N Y Acad Sci，2004，1012(1):267-281.

[7] Murphy C J，Oudit G Y.Iron-overload cardiomyopathy:Pathophysiology,diagnosia，and treatment[J].J Card Fail,2010，16(11):888-900.

[8] Minamiyama Y，Takemura S，Kodai，S，et al.Iron restriction improves type 2 diabetes mellitus in Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2010，298(6):E1140-E1149.

[9] Raipathak S N，Crandall J P，Wylie-Rosett J，et al.The role of iron in type 2 diabetes in humans[J].Biochim Biophys Acta,2009，1790(7):671-681.

[10] 汪家政，范明.蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊[M].北京:科學(xué)出版社，2000:189-211.

[11] Sz?kefalvi-Nagy Z，Bagyinka C，Demeter I，et al.Location and quantification of metal ions in enzymes combining polyacrylamide gel electrophoresis and particle-induced X-ray emission[J].Biol Trance Element Res，1990，26-27(1):93-101.

[12] Sz?kefalvi-Nagy Z，Bagyinka C，Demeter I，et al.Speciation of metal ions in proteins by combining PIXE and thin layer electrophoresis[J].Fresenius J Anal Chem，1999，363(5-6):469-473.

[13] 高愈希，陳春英，趙九江，等.一種改進(jìn)的同步輻射X-射線熒光原位分析人肝細(xì)胞胞質(zhì)溶膠內(nèi)金屬蛋白分布方法[J].分析化學(xué)，2003，31(4):395-398.

[14] 陳春英，章佩群，高愈希，等.用同步輻射X熒光分析法研究兔肝金屬硫蛋白中的微量元素[J].核技術(shù)，2003，26(1):17-20.

[15] 陳春英，章佩群，柴之芳，等.同步輻射X熒光分析法原位測定人肝金屬蛋白中的微量元素[J].中國科學(xué)(A輯)，2000，30(2):182-186.

[16] Hsu D Z，Chen K T，Chien S P，et al.Sesame oil attenuates acute iron-induced lipid peroxidation-associated hepatic damage in mice[J].Shock，2006,26(6):625-630.

[17] Wang J，Dreessen D，Wiederin D R，et al.Measurement of trace elements in proteins extracted from liver by size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry with a magnetic sector mass spectrometer[J].Anal Biochem，2001，288(1):89-96.