HPLC法測(cè)定陸英中綠原酸的含量

劉立榮

摘 要：本研究以陸英為研究對(duì)象，對(duì)具有抗肝炎活性的化學(xué)成分綠原酸進(jìn)行了提取工藝、含量測(cè)定方法的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：綠原酸在0.8～40 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9998，平均回收率為96.1%，RSD值為4.5%。該方法準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，為評(píng)價(jià)陸英質(zhì)量提供了一個(gè)定量依據(jù)。

關(guān)鍵詞：陸英 提取工藝 質(zhì)量評(píng)價(jià) 高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2012）12（b）-0-01

該文建立了陸英藥材中綠原酸的HPLC含量測(cè)定的方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為全面評(píng)價(jià)陸英藥材質(zhì)量提供了定量依據(jù)。

1 藥品、色譜條件及其優(yōu)化、對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備

1.1 藥品

綠原酸對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.2 色譜條件

色譜柱：phenomenexC18反相色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相：（A）乙腈-（B）0.8%甲酸水溶液梯度洗脫：0～12 min：

A7%升至11%，B 93%降至89%；

12～49 min：A11%升至25%B89%降至75%。檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm。流速：1.0 ml/min。柱溫：35 ℃。進(jìn)樣量：20 μl。

1.3 色譜條件的優(yōu)化

①流動(dòng)相系統(tǒng)的考察：試驗(yàn)采用乙腈-水系統(tǒng)，由于目標(biāo)成分為酸性物質(zhì)，經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，最終確定采用乙腈-0.8%甲酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。②流速的影響：考察了流速為0.8、1.0、1.2 ml/min對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明流速為1.0 ml/min時(shí)分離效果最佳。③柱溫的影響：考察了柱溫為30、35 ℃對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明柱溫為35 ℃時(shí)分離效果最佳。綜上所述，最終確定以采用乙腈- 0.8%甲酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，柱溫為35 ℃。

1.4 對(duì)照品溶液的制備

分別取綠原酸的對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為

0.402 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液I，備用。再精密量取儲(chǔ)備液I 0.10 ml，置5 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為8.04 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液Ⅱ。

1.5 供試品溶液的制備

取陸英藥材粉末約1.0 lg，精密稱定，至100 ml錐行瓶中，加100 ml85%甲醇溶液，超聲提取1.0 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾后取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次分別精密稱取綠原酸的儲(chǔ)備液I 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置于10 ml量瓶中；再分別精密稱取儲(chǔ)備液Ⅱ1.0 ml，至10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述溶液20 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以對(duì)照品峰面積A對(duì)濃度C（μg/ml）回歸分析，得綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，綠原酸的回歸方程為：A=5.8×104C-28121（r=0.9998，n=7）。結(jié)果表明，綠原酸在0.8～40 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）

檢測(cè)限是信噪比為3時(shí)的被測(cè)物濃度，為能從背景信號(hào)中區(qū)分出被檢測(cè)物的最低濃度。定量限是信噪比為10時(shí)的被測(cè)物濃度，是指在保證具有一定可靠性的前提下，能夠測(cè)定出的樣品中被測(cè)物的最低濃度。通過(guò)重復(fù)測(cè)量3次求的平均值，RSD平均值小于5%，綠原酸的檢測(cè)限和定量限分別為1.28 ng/ml和3.84 ng/ml。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取陸英藥材粉末5份，約1.0 g，精密稱定1.005 g。進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖峰面積：412028、389181、390383、412370和419431，RSD=3.4%。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取陸英藥材粉末約1g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”的方法制備供試品溶液，避光保存，備用。分別在0，4，8，12，24，48 h測(cè)試一次，記錄色譜峰面積分別為：381583、380548、377956、376437和374985，RSD為0.7%。結(jié)果表明所有分析物在常溫下，48 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5 回收率試驗(yàn)

向含量已知的陸英樣品中加入已知量（72.6 μg）的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后進(jìn)行提取和HPLC測(cè)試，通過(guò)測(cè)得量和加入量的比值計(jì)算回收率 。提取回收率考察了3個(gè)不同濃度，即分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線的高、中、低三個(gè)水平，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。方法的平均回收率為96.1%（100±10%），且RSD=4.5%（小于5%），表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法具有良好的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)語(yǔ)

該文考察了提取溶劑的濃度、提取溶劑用量、提取時(shí)間三個(gè)因素，對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

考察50%到90%的甲醇溶劑作為提取溶劑對(duì)提取效率的影響：稱取藥材粉末1.00 g，分別加入50%、70%、85%和90%的甲醇，超聲提取相同時(shí)間，平行操作4次，所得峰面積分別為：271254、367806、414800和424131。結(jié)果表明隨著甲醇濃度增加，提取效率增加，但同時(shí)被提出的脂溶性雜質(zhì)也增多，干擾目標(biāo)成分的測(cè)定，最終確定85%甲醇溶劑為提取溶劑。以85%甲醇溶劑為提取溶劑，考察溶劑量從50 ml到120 ml的提取效率。操作過(guò)程同上，所得50、100、120 ml的峰面積分別為364216、426583和429823。

可見(jiàn)，隨著甲醇濃度增加，提取效率增加，但是100 ml和120 ml提取的量相差不多，所以最終確定以85%甲醇100 ml為提取溶劑。在確定提取溶劑量和濃度之后，試驗(yàn)考察了從30 min到90 min提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響。操作過(guò)程同上，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，60 min和90 min的提取效率相差不多，最終確定為60 min為提取

時(shí)間。

表1 陸英中被測(cè)物質(zhì)的回收率（n=3）

加入量

（μg） 測(cè)得量

（μg） 回收率

（%）

40 113.5 101.3

40 114.0 102.0

40 114.8 103.1

80 146.4 91.5

80 148.8 94.8

80 147.9 93.6

120 187.6 93.1

120 188.1 93.8

120 186.5 91.6

表2 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響

時(shí)間

（min） 峰面積

綠原酸 咖啡酸 阿魏酸

30 267957 127833 163121

60 390383 186810 214337

90 389181 185721 217543

因此，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取方法為：稱取藥材粉末1.0 g，加入85%甲醇溶劑100 ml，超聲提取1.0 h。綜上所述，該方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好，為評(píng)價(jià)陸英中綠原酸的含量提供了一個(gè)定量依據(jù)。