熱療對增強(qiáng)阿霉素治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤敏感性研究

王向軍

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科 鄭州 450014

神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）又稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞多種腫瘤的總稱，其惡性膠質(zhì)瘤在原發(fā)性腫瘤中占35%～45%［1］，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見且最難治療的惡性腫瘤，手術(shù)切除、放療及化療等傳統(tǒng)治療方法能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生一定的治療作用，但在過去的很多年中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后及自然發(fā)生、發(fā)展過程并未得到明顯改善，因此開發(fā)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤有效的新方法勢在必行。

腫瘤熱療（tumor hyperthermia）是近年來快速發(fā)展起來的一類治療癌癥的新方法，基本原理是利用外加的物理能量（如溫?zé)崴?、微波或超聲波等）加熱，使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度，破壞腫瘤細(xì)胞的代謝和結(jié)構(gòu)，從而殺滅腫瘤細(xì)胞。目前，腫瘤熱療成為繼手術(shù)、放療、化療和免疫療法之后的第五大療法。阿霉素（adriamycin，ADM）是一種目前臨床常用的廣譜抗癌藥，用于多種腫瘤的治療，具有熱療增敏性和PH敏感性。將熱療與化療聯(lián)合應(yīng)用可對化療起到增效作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討U251細(xì)胞株對阿霉素的熱療增敏作用。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）、胎牛血清（四季青公司）、磺酰羅丹明B（sigma公司）、阿霉素（萬樂藥業(yè)）、FITC標(biāo)記的P－gp抗體和山羊抗小鼠IgG1（eBioscience公司）、細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。酶標(biāo)儀（DYNEX公司）、流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特有限公司）、UHR－2000高能聚束微波熱療機(jī)（華源醫(yī)療設(shè)備有限公司）、高效液相色譜儀（島津公司）。細(xì)胞培養(yǎng)：將U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清（FBS）10%、青鏈霉素混合液1%的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2，每2～3d傳代一次。藥物工作濃度確定：阿霉素設(shè)0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg／mL組，每組3個復(fù)孔，SRB法測定細(xì)胞抑制率，以48h的IC50作為工作濃度。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、熱療組、化療組、熱化＋療組。以上各組分別給予相應(yīng)的化療和（或）熱療處理：將U251細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105／mL種于6孔板中，化療組和熱化療組中加入工作濃度的阿霉素，熱療組和熱療＋化療組細(xì)胞在UHR－2000微波輻射器下進(jìn)行加溫，溫度達(dá)42℃時，維持60min。

1.3臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞的存活率分別取各組細(xì)胞懸液稀釋，使各組細(xì)胞數(shù)相同，分別吸出0.9mL均勻細(xì)胞液加0.1mL 0.4%的臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)3次取均值。細(xì)胞生存率＝活細(xì)胞總數(shù)／（活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4 SRB法測定細(xì)胞增殖率將U251細(xì)胞以每孔5×103個接種到96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，將各組細(xì)胞分別給予熱療、化療或熱療＋化療處理。培養(yǎng)48h后加入50%三氯醋酸50μL，4℃固定1h；超純水洗5遍，風(fēng)干；加0.4%的SRB 50μL，避光染色30min；1%乙酸洗5遍，風(fēng)干，加入10mmol／L Tris堿150μL溶解，酶標(biāo)儀測定吸光度。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率／%＝（1－實(shí)驗(yàn)組光吸收值）／對照組光吸收值×100%。

1.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率用PBS洗滌處理48h的細(xì)胞2次，每組（1～5）×105細(xì)胞；加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5μL Annexin V－FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15min；1h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡率。

1.6高效液相色譜法HPLC測定細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度U251細(xì)胞反復(fù)凍融離心，取上清為細(xì)胞內(nèi)液，用HPLCA法測定細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量。測定條件：色譜柱：Agilent 1200E－clipse XDB－C 18柱（4.6mm×150mm，5μm）；檢測器：熒光FLD檢測器；流動相：甲醇：0.01mol／mL磷酸二氫鉀：冰乙酸＝68∶32∶0.5；流速：1.0mL／min；柱溫30℃；進(jìn)樣量40 μL；檢測波長：激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長550nm［2］。

1.7流式細(xì)胞儀測定U251細(xì)胞內(nèi)Bcl－2的表達(dá)情況取U 251細(xì)胞接種于六孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2×105個，分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48h收集細(xì)胞，加入100μL破膜劑及5μL Bcl－2／FITC和 Mouse IgG1／FITC，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.8流式細(xì)胞儀測定U251細(xì)胞內(nèi)P－gp的表達(dá)情況取U251細(xì)胞接種于六孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)2×105個，分組進(jìn)行處理后繼續(xù)培養(yǎng)48h收集細(xì)胞，用PBS洗滌，加入10μL的P－gp／FITC和 Mouse IgG1／FITC，將反應(yīng)物置于37℃冰箱內(nèi)孵育60min，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用單向方差分析（One－way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1阿霉素工作濃度的確定SRB法測得濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg／mL的阿霉素分別作用于 U251細(xì)胞后，各組抑制率分別為3.22±0.31、9.67±0.95、25.47±2.45、33.89±3.33、57.48±4.01、74.51±4.62、92.64±5.63。U251對阿霉素的IC50為1.45μg／mL，并以此藥物濃度進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。

2.2細(xì)胞存活率通過以上方法對U251細(xì)胞進(jìn)行處理48 h后，熱療組、化療組、熱療＋化療組的存活率均比空白對照組細(xì)胞存活率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；熱療＋化療組的細(xì)胞存活率分別比單純化療組和單純熱療組顯著降低（P＜0.01）。見表1。

2.3細(xì)胞抑制率化療、熱療及熱療＋化療組均對U251細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用；同時化療組、熱療組與熱療＋化療組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。數(shù)據(jù)見表1。

2.4阿霉素聯(lián)合熱療對U251細(xì)胞的凋亡作用化療組、熱療組及熱療＋化療組細(xì)胞凋亡率分別較對照組明顯升高（P＜0.01）；同時，熱療＋化療組的細(xì)胞凋亡率較熱療組及化療組的凋亡率均明顯升高（P＜0.01）。見表1。

2.5熱療對U251細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響經(jīng)熱療處理后，細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度由（9.03±0.84）pg／mL上升至（36.52±2.97）pg／mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明熱療能提高U251細(xì)胞對ADM蓄積的能力。見表1。

2.6 U251細(xì)胞中Bcl－2的表達(dá)按照試驗(yàn)操作處理48h后，檢測U251細(xì)胞內(nèi)Bcl－2的表達(dá)率。結(jié)果顯示：化療組、熱療組及熱療＋化療組細(xì)胞中的Bcl－2表達(dá)率與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且熱療＋化療組細(xì)胞Bcl－2表達(dá)率分別與熱療組、化療組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.7 U251細(xì)胞中P－gp的表達(dá)按照試驗(yàn)操作處理48h后，檢測U251細(xì)胞內(nèi)P－gp的表達(dá)率。結(jié)果顯示：化療組、熱療組及熱療＋化療組細(xì)胞中的P－gp表達(dá)率與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且熱療＋化療組細(xì)胞P－gp表達(dá)率分別與熱療組、化療組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

3 討論

由于腫瘤組織及其周圍血管對溫度的敏感性，利用熱療的方法可有效將其殺滅［3］。近些年，腫瘤熱療受到了人們的廣泛關(guān)注［4－5］。同時，熱療和化療聯(lián)合治療腫瘤具有明顯的增強(qiáng)作用，原因可能是熱療使藥物滲入細(xì)胞量增加、蛋白質(zhì)變性及化療藥物的藥動學(xué)改變等。本研究使用的化療藥物為阿霉素，阿霉素是一種有效的熱療增敏劑，將其與熱療聯(lián)合可以有效增強(qiáng)治療效果［6－7］。

有文獻(xiàn)報道，熱療殺滅腫瘤細(xì)胞的臨界溫度是42℃，目前臨床上所用的熱療溫度也大都是41～43℃，因此本研究中熱療的處理溫度設(shè)定為42℃。細(xì)胞存活率、細(xì)胞抑制率及細(xì)胞凋亡率的考察結(jié)果顯示，熱療＋化療組與單純熱療組、單純化療組及空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；進(jìn)一步測定細(xì)胞內(nèi)ADM的濃度，發(fā)現(xiàn)熱療＋化療組的ADM濃度比其他組明顯升高，原因可能是熱療使藥物滲入細(xì)胞量增加，此外熱療能夠降低瘤組織的pH值，ADM在pH值相對較低的情況下會加強(qiáng)釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部［8］；熱療＋化療組細(xì)胞的P－gp蛋白及Bcl－2蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)節(jié)（P＜0.01），這說明熱療可能通過降低多藥耐藥蛋白P－gp的表達(dá)，使化療藥物的外排下降，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度提高，從而增加了U251細(xì)胞對ADM化療的敏感性。同時多數(shù)研究也相繼表明，熱療可有效降低細(xì)胞內(nèi)P－gp的表達(dá)和Bcl－2的表達(dá)［9－10］。

本研究結(jié)果表明，熱療聯(lián)合化療能增強(qiáng)ADM對U251細(xì)胞的體外抑制作用，提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ADM累積量，聯(lián)合熱療可有效下調(diào)P－gp及Bcl－2蛋白的表達(dá)?？傮w來說，提高了U251細(xì)胞對阿霉素化療的敏感性。這為神經(jīng)膠體瘤的治療提供了一種新的手段，但此方法仍需更多的實(shí)驗(yàn)支持，為臨床應(yīng)用提供充分的依據(jù)。

表1 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率、抑制率、凋亡率及熱療對細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響 （s，%）

表1 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率、抑制率、凋亡率及熱療對細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響 （s，%）

注：與空白對照組比，＊P＜0.01；與化療組比，△P＜0.01；與熱療組比，○P＜0.01

3 98.72±0.02 － 1.56±0.14 －熱療組 3 50.58±3.54＊ 45.74±2.36 20.49±1.97＊ －化療組 3 43.98±3.27＊ 52.25±4.91 16.33±1.69＊ 9.03±0.84＊熱療＋化療組 3 25.95±2.21＊△○ 71.37±5.42＊△ 45.36±3.97＊△○ 36.52±2.97空白對照組＊△○

表2 U251細(xì)胞經(jīng)過熱療、化療及熱療＋化療處理后Bcl－2及P－gp表達(dá)的情況 （s）

表2 U251細(xì)胞經(jīng)過熱療、化療及熱療＋化療處理后Bcl－2及P－gp表達(dá)的情況 （s）

注：與空白對照組比，＊P＜0.01；與化療組比，△P＜0.01；與熱療組比，○P＜0.01

組別 P－gp Bcl－2空白對照組76.5±3.2 74.89±4.5熱療組 53.9±4.9＊ 59.14±5.0＊化療組 50.3±4.6＊ 65.67±3.8＊熱療＋化療組 25.2±3.7＊△○ 40.52±3.6＊△○

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