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    丹皮酚對大腸癌細胞端瞄聚合酶的影響

    2012-03-19 10:50:47夏士濤譚詩云朱衛(wèi)芳劉長青
    關(guān)鍵詞:丹皮端粒電泳

    夏士濤,譚詩云,朱衛(wèi)芳,劉長青

    1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北 武漢 430060;2.荊門市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

    1998年Smith等利用TRF1(端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1)在酵母雙向雜交實驗誘導(dǎo)而發(fā)現(xiàn)的一種新的端粒相關(guān)蛋白-端錨聚合酶(TRF1-interacting ankyrin related ADP-ribose polymerase,Tankyrase)[1],其主要功能之一是通過對TRF1的糖基化修飾調(diào)節(jié)端粒長度,在腫瘤的發(fā)生過程中起作用[2],Tankyrase1有望成為繼端粒酶后,對細胞的生長、衰老、癌變起極其重要作用的調(diào)控因子[3-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚具有體外抗大腸癌細胞的作用[5],然而丹皮酚對大腸癌細胞Tankyrase1表達的影響目前尚不十分清楚,本研究對此進行探討。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 人結(jié)腸癌:HT-29細胞株購自中南大學(xué)腫瘤研究所,正常人結(jié)腸細胞:NCM460細胞系購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

    1.1.2 主要試劑:丹皮酚注射劑:上海第一制藥廠(10 mg/2 mL,批號:990402),臨用前用 RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成終濃度為3.91~250 mg/L;RPMI 1640培養(yǎng)基:美國GIBCO公司產(chǎn)品;小牛血清:杭州四季青生物材料研究所提供;瓊脂粉:武漢亦新生物技術(shù)有限責(zé)任公司;胰酶:武漢亦新生物技術(shù)有限責(zé)任公司;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液:Promega,Oligo(dT)18上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,dNTPmix華美生物工程公司;RNase inhibitior:華美生物工程公司;Taq酶:上海賽百盛生物技術(shù)有限公司;PCR反應(yīng)緩沖液:上海賽百盛生物技術(shù)有限公司;50 bp GeneRuler DNA Ladder:上海賽百盛生物技術(shù)有限公司,100 bp GeneRuler DNA Ladder:上海賽百盛生物技術(shù)有限公司;TBE緩沖液:DecentBio。引物:Tankyrase1上游引物5'-CTCTCCTGGCTGTTCTTTGG -3',下游引物 5'-ATCGGGCACTCGTCTGTAAC -3',PCR產(chǎn)物長度為188 bp,由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成特異性內(nèi)參β-action:上游引物5'-GCGCTCGTCGTCGACAACGG -3',下游引物5’-GTGTGGTGCCAAATCTTCTCC -3',PCR 產(chǎn)物長度為238 bp,由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

    1.1.3 主要儀器設(shè)備:PCR基因擴增儀(PTC100/PE9700):Biometra,電泳儀:上海復(fù)日科技有限公司;電泳成像拍照(EDAS290):Vilber Lourmat,PCR primer design software(Primer 5):PREMIER Biosoft International,UV-1700 pharmaspec UV-visible spectrophotometere:SHIMADZU。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng):將正常大腸細胞和HT-29細胞培養(yǎng)在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,加人青霉素100 u/L,鏈霉素100 u/L,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每3~4 d用0.25%胰酶消化傳代1次,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    1.2.2 實驗分組:有正常大腸細胞和大腸癌細胞兩種細胞株,分別給兩種細胞株加入不同濃度的丹皮酚,以加入等量的細胞培養(yǎng)液為對照組,這樣實驗分成四組:第一組為大腸癌細胞,第二組為加入丹皮酚的大腸癌細胞,第三組為正常大腸細胞,第四組為加入丹皮酚的正常大腸細胞。丹皮酚的濃度分度分別為3.91 mg/L、7.81 mg/L、15.63 mg/L、31.25 mg/L、62.5 mg/L、125 mg/L、250 mg/L,對每一組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后分別提取總mRNA。

    1.2.3 總 RNA的提取:取培養(yǎng)瓶中的細胞液置入1.5 mL EP管中,加入1 mL Trizol,冰上劇烈震蕩混勻;將溶液置于室溫5 min,以徹底降解核蛋白產(chǎn)物,加預(yù)冷的0.2 mL氯仿,劇烈震蕩15 s,室溫放置5 min;4℃離心,12000 r/min×15 min,仔細吸取上層水相,移至另一新EP管,加入0.4 mL冰冷異丙醇,充分混勻后室溫放置10 min,4℃離心,12000 r/min×10 min,棄上清,加入冰冷的75%乙醇0.8 mL,混勻洗滌RNA 10 min,4 ℃離心,10000 r/min×3 min,棄上清,管口敞開,室溫干燥RNA 10 min,使乙醇揮發(fā);加入20 μL DEPC處理的無菌水,槍頭輕輕混勻幾次,55~60℃孵育20 min以溶解RNA。

    1.2.4 RNA純度和濃度檢測:比色皿用95%的酒精洗兩遍,再用DEPC水洗兩遍后加入3 mL DEPC水調(diào)零,再加入5 μL RNA混勻,應(yīng)用UV 240型紫外分光光度儀測定核酸吸光度 A260和 A280值。計算A260/A280,其值應(yīng)在 1.8~2.0之間,如果比值 >2.0,說明 RNA 可能降解;如果比值 <1.8,說明有蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)殘留。按OD260=1時RNA含量約為40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)計算RNA濃度。取A260/A280比值>1.80者分為2 μL/管,-75℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):引物OD值為10D,短暫離心后用無菌雙蒸水溶解稀釋為10 pmol/μL,小量分裝儲存于-75℃冰箱。由細胞株提取的總RNA兩步法擴增DNA目的片斷。RT反應(yīng)(20 μL體系):DEPC處理過的無菌0.2 mL薄壁 EP管置于冰上,其中混合:總RNA(0.5 μg/μL)2 μL;Oligo(dT)18 Primer(0.5 μg/μL)1 μL;DEPC 水7 μL;輕輕混勻,離心 5 s;將混合物置于70℃下5 min,迅速置于冰上冷卻,短暫離心;將混合物置于冰上,并依次加入下列試劑:5×Buffer 4 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;RNase inhibitor(20 u/μL)1 μL混勻,稍離心,將混合物置于37℃下5 min;向混合物加入 MMLV(200 u/μL)1 μL,終體積為 20 μL,上PCR儀,在42℃孵育60 min逆轉(zhuǎn)錄;再放入70℃孵育10 min以終止反應(yīng);并在4℃保溫,防止二級結(jié)構(gòu)形成;并分裝2 μL/管,-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng):無菌0.2 mL薄壁EP管,依次加入以下試劑:cDNA 1.5 μL;上游引物(10 pmol/μL)1 μL;下游引物(10 pmol/μL)1 μL;10 × Buffer 2.5 μL;Mg2+(20 mmol/L)1.5 μL;dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL;無菌雙蒸水 14 μL;Taq 酶 (1 u/μL)1 μL;終體積為 25 μL;反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 10 min,變性95℃ 30 s,退火58℃ 30 s,延伸72℃ 30 s,一共循環(huán)45次;72℃5 min終止反應(yīng),最后4℃保存,-20℃冰箱保存待測。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳:加5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物及1 μL溴酚藍于點樣孔,電泳50~80 V(5 V/cm),20 min,將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于EDAS290電泳成像儀中拍照并用Kodak1D 3.5專用軟件進行圖像分析,記錄結(jié)果。Tankyrase1的相對表達量分別以其PCR產(chǎn)物的A值與β-actin PCR產(chǎn)物A值之比計算。

    1.2.6 RNA 凝膠電泳:取1 μL 的總 RNA 在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳,確定RNA的質(zhì)量和完整性。真核細胞的28S/18S的比值約為2∶1,如果比值逆轉(zhuǎn),則表明RNA降解。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)以表示,單一兩組均數(shù)之間進行t檢驗,多組間均數(shù)以方差分析(ANOVE)進行組間比較,均數(shù)之間的多重比較以SNK進行q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 RNA測定結(jié)果 本實驗抽提的四組細胞中總RNA,電泳結(jié)果可見清晰的28S、18S和5S條帶,說明所提取的總RNA樣本無降解,質(zhì)量良好。

    2.2 RT-PCR的結(jié)果 經(jīng)RT-PCR擴增后Tankyrase1基因轉(zhuǎn)錄本片段大小為與理論值相符。

    實驗結(jié)果表明:(1)RT-PCR擴增的Tankyrase1 cDNA產(chǎn)物(目的基因與內(nèi)參拷貝數(shù)的比值)在大腸癌細胞中的表達(0.875±0.037)比在正常對照組升高(0.1532 ±0.108)(P <0.05),而在給予丹皮酚干預(yù)后的Tankyrase1(0.356 ±0.018)表達較下降(P <0.05),但在正常大腸細胞組(0.1532 ±0.108)與正常細胞加丹皮酚組中(0.2379±0.012)并未出現(xiàn)這種顯著性的改變(P>0.05)。丹皮酚在15.63~250 mg/L濃度范圍內(nèi)對HT-29細胞中Tankyrase1 mRNA的表達有影響。

    3 討論

    近年多種研究表明非甾體類抗炎藥(NSIADs)如阿司匹林等能減少人類和實驗動物大腸癌的發(fā)生[6],但長期應(yīng)用時不良反應(yīng)較多,最常見的是胃腸道反應(yīng),可出現(xiàn)胃潰瘍或胃出血,因而限制了其在臨床上的廣泛使用。

    丹皮酚為中藥牡丹皮的主要活性成分,藥理研究表明,牡丹皮的有效成分具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用[7-8],如解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用等,且其副作用小,在臨床上可大劑量使用。

    本實驗研究發(fā)現(xiàn),丹皮酚在3.91~250 mg/L的4個濃度下,在 3.91 mg/L濃度下大腸癌細胞中Tankyrase1 mRNA表達與未加丹皮酚組相比,無顯著性差異(P>0.05),后三者與未加丹皮酚組相比,有顯著性差異,且有明顯的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。推測在丹皮酚作用下,大腸癌HT-29細胞的Tankyrase1 mRNA表達下調(diào),已發(fā)生二磷酸腺苷核化的TRF1去糖基,再次恢復(fù)與端粒與端粒DNA結(jié)合的能力,使端粒處于“結(jié)合”狀態(tài),當(dāng)與端粒DNA結(jié)合的TRF1到一定數(shù)目時,這個數(shù)目取決于丹皮酚的濃度和作用時間,達到臨界數(shù)時,就抑制調(diào)節(jié)端粒長度的“蛋白計數(shù)”機制從而抑制端粒酶端粒,端粒延長終止。

    [1]Smith S,Giriat I,Schmitt A,et al.Tankyrase,a Poly(ADP-Ribose)Polymerase at Human Telomeres[J].Science,1998,282(11):1484-1487.

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