Ki－67表達及幽門螺桿菌感染在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中的作用

程艷麗，林 靜，劉晉紅，顧 雁，劉秀清，王亞麗，閆 偉，李玉紅，張明奎

清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.消化內(nèi)科;2.病理科;3.心臟中心，北京 100016

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因之一，與胃癌發(fā)生關(guān)系密切。在H.pylori感染相關(guān)性胃炎、胃潰瘍及胃癌病變中，H.pylori可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞凋亡，并促進其增殖［1-2］。Ki-67的表達與細胞增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細胞周期必不可少的組成部分，也是目前較為肯定的核增殖標志基因，存在于細胞周期中除G0期以外的所有階段。Ki-67作為一個重要的細胞增殖標記［3］，在胃腸道間質(zhì)瘤及胃癌組織中均有高表達，Ki-67標記指數(shù)可作為胃腸道間質(zhì)瘤的預(yù)測指標，并與癌的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)［4-5］。但 H.pylori及 Ki-67在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中的作用尚無定論。本文通過研究Ki-67表達及H.pylori在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中的作用，以進一步揭示阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜病變的相關(guān)機制，指導(dǎo)臨床安全使用阿司匹林。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機從2008年12月－2011年1月清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科及心臟中心服用阿司匹林導(dǎo)致相關(guān)性胃黏膜病變患者中選擇病例189例，均經(jīng)胃鏡檢查明確診斷，并排除賁門黏膜撕裂癥、消化道腫瘤、食管胃底靜脈曲張破裂導(dǎo)致出血病例，同時排除嚴重肝腎功能不全的患者以及1個月內(nèi)有重大手術(shù)的患者。既往史中無消化道癥狀，如:上腹部疼痛、反酸、燒心、噯氣、惡心、嘔吐、食欲減退等，共136例病例入選，年齡50～78歲，平均年齡(65.66±6.01)歲。患者服用阿司匹林劑量為75～325 mg，時間最短3 d，最長2年。

1.2 臨床分組 患者在10 d內(nèi)服用阿司匹林后有嘔血和/或黑便癥狀，大便和嘔吐物隱血檢查陽性，就診24 h內(nèi)經(jīng)胃鏡檢查確診為胃和/或十二指腸潰瘍或黏膜糜爛出血，定為出血組;患者服用阿司匹林后在7 d～6個月出現(xiàn)消化道癥狀，如:上腹部疼痛、反酸、燒心、噯氣、惡心、嘔吐、食欲減退，就診24～48 h內(nèi)經(jīng)胃鏡檢查確診為胃和/或十二指腸潰瘍，定為潰瘍組;患者服用阿司匹林后在7 d～6個月出現(xiàn)消化道癥狀，就診24～48 h內(nèi)經(jīng)胃鏡檢查確診為非萎縮性胃炎伴/或不伴糜爛，萎縮性胃炎伴/或不伴糜爛，定為胃炎組;出血組患者24例，其中男16例，女8例;潰瘍組患者46例，其中男28例，女18例;胃炎組患者66例，其中男44例，女22例。對照組為健康體檢者正常胃黏膜排除H.pylori感染，共8例，男6例，女2例，年齡19～30歲，平均年齡(25.00±4.31)歲。所有入選病例均行快速尿素酶試驗檢測、病理組織學(xué)Geimsa染色及13C尿素呼氣試驗，以上3項指標中有2項陽性定為H.pylori感染陽性，分為H.pylori感染陽性組和陰性組，并取胃黏膜組織行Ki-67檢測。

1.3 主要試劑及實驗方法

1.3.1 主要試劑:兔抗人Ki-67免疫組化單克隆抗體及S-P試劑盒均購自福州邁新公司。胃幽門螺桿菌快速尿素酶診斷試劑盒、試劑購自福建三強生物化工有限公司。13C尿素呼氣試驗?zāi)蛩啬z囊試劑藥盒購自原子高科股份有限公司，13C呼氣質(zhì)譜儀:ZHP2001型，購自北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.3.2 實驗方法:(1)幽門螺桿菌檢測:行胃鏡檢查時均在胃竇部取活組織2塊，其中一塊應(yīng)用胃幽門螺桿菌快速尿素酶診斷試劑盒進行檢測。另一塊組織行病理組織學(xué)Giemsa染色;所有患者均行13C尿素呼氣試驗，陽性判斷值:以30 min時樣品中所測13C-CO2的δ‰減去零時的呼氣樣品的δ‰值的差表示，即檢測值=δ‰(30 min)－δ‰(0 min)，陽性判斷值≥4.0 ±0.4時，可判斷受試者為陽性。(2)Ki-67免疫組織化學(xué)染色檢測步驟:胃黏膜組織經(jīng)10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，4～5 μm厚連續(xù)切片后，采用免疫組織化學(xué)染色(S-P法)檢測Ki-67的表達，步驟參考試劑盒說明書操作，用已知的陽性切片作陽性對照，以 0.01 mmol/L PBS代替一抗作陰性對照。并用HE染色行常規(guī)病理組織學(xué)診斷。

1.4 H.pylori感染的診斷標準 以上3項指標中有2項陽性，判定為H.pylori感染。

1.5 胃黏膜組織中Ki-67表達水平的計算方法 用半定量法推算各檢測樣本Ki-67表達情況［6］，分別按以下比例記分:胃黏膜上皮組織細胞染色陽性率在0～4%記0分，5% ～24%記1分，25% ～49%記2分，50% ～74%記3分，75% ～100%記4分;染色強度陰性為0分，染色弱，但明顯強于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，染色強者為3分。Ki-67表達水平用胃黏膜上皮組織細胞陽性率與染色強度評分的乘積來表示。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori感染率 在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori感染率在出血組、潰瘍組及胃炎組相比較無明顯差異(P＞0.05，見表1)。

表1 阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變患者H.pylori感染狀況Tab 1 H.pylori infection status of patients with aspirin associated gastric mucosa injury diseas

2.2 阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變組織中Ki-67表達情況 在正常胃黏膜上皮組織Ki-67無表達或呈弱陽性表達，平均染色積分為0.125±0.354。在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，胃黏膜上皮組織有較強程度的表達，細胞胞質(zhì)著色，呈彌漫或灶狀分布。在出血組中，有58.33%(14/24)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒(見圖1)，平均染色積分為3.916 ±1.676;在潰瘍組，有 21.74%(10/46)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均染色積分為2.174 ±1.527;在胃炎組，有12.12%(8/66)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒(見圖2)，平均染色積分為 1.394±0.899。出血組中胃黏膜上皮組織Ki-67的表達高于潰瘍組及胃炎組(P＜0.05);Ki-67的表達在任兩組間總體均數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 H.pylori感染狀態(tài)與阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中Ki-67表達的關(guān)系 在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori感染陽性率為 75.00%(102/136)。H.pylori感染陽性患者有25.49%(26/102)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均染色積分為2.275 ±1.511;H.pylori感染陰性患者有17.65%(6/34)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均染色積分為 1.588 ±1.698。H.pylori感染陽性患者的胃黏膜上皮組織中Ki-67陽性表達率明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 Ki-67在出血組胃黏膜上皮組織的表達(SP 100×);圖2 Ki-67在胃炎組胃黏膜上皮組織的表達(SP 100×)Fig 1 Expression of Ki-67 in gastric mucosa in bleeding group(SP 100×);Fig 2 Expression of Ki-67 in gastric mucosa in gastritis group(SP 100×)

3 討論

細胞增殖分裂受多種因素調(diào)節(jié)。在細胞周期中，細胞DNA復(fù)制合成、有絲分裂除必需有關(guān)酶系參與外，還有些蛋白質(zhì)與細胞增殖密切相關(guān)，并可被相應(yīng)抗體識別，被稱為細胞增殖相關(guān)抗原，如增殖細胞核抗原、Ki-67、核仁組成區(qū)嗜銀蛋白、statin、p53。其中，Ki-67抗原是1984年由Gerdes等［7］發(fā)現(xiàn)在增殖細胞中表達的一種核抗原，由分子量分別為395 KD和345 KD的雙鏈多肽組成，由人類基因組中約3000 bp編碼。由于Ki-67結(jié)構(gòu)獨特，缺乏與之同源的序列進行對比研究，盡管目前掌握了結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征方面的大量資料，但其生理功能仍不清楚。大量實驗研究證明Ki-67的表達與細胞增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細胞周期必不可少的組成部分。也是目前較為肯定的核增殖標志基因，存在于細胞周期中除G0期以外的所有階段。它開始表達于細胞周期的G1期，在S期及G2期表達增加，至M期達高峰，在分裂晚期很快消失。由于其半衰期短，脫離細胞周期后迅速降解，因此，被認為是能較可靠地全面反映細胞群體增殖活性的客觀指標［8-9］，已成為目前檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標［7］。Ki-67在非腫瘤性胃黏膜中不表達或低表達，說明該組織增生活性較低。在胃腸道間質(zhì)瘤及胃癌組織中均有高表達，Ki-67標記指數(shù)可作為胃腸道間質(zhì)瘤的預(yù)測指標，并與癌的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)［4-5］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，非甾體類消炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)吲哚美辛可導(dǎo)致大鼠胃黏膜上皮細胞增殖減少，Ki-67表達下調(diào)［10］。既往在阿司匹林誘發(fā)導(dǎo)致胃黏膜損傷的分子機制方面，認為阿司匹林除可直接刺激胃黏膜外，同時可通過抑制環(huán)氧化酶1(Cyclooxygenase-1，COX-1)阻斷花生四烯酸代謝成前列腺素(Prostaglandins，PG)，從而抑制前列腺素的合成而致胃黏膜損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，在正常胃黏膜上皮組織Ki-67無表達或呈弱陽性表達，平均積分為0.125 ±0.354，在阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜病變中，出血組有58.33%(7/12)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均積分為3.916±1.676;潰瘍組有21.74%(5/23)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均積分為2.174±1.527;胃炎組有12.12%(4/33)的胃黏膜上皮組織細胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯的黃色顆粒，平均積分為1.394±0.899。出血組中Ki-67的表達高于潰瘍組及胃炎組的胃黏膜上皮組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);說明在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，隨著胃黏膜損傷的加重，Ki-67的表達增強，細胞增殖明顯，細胞增殖可能是阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變的發(fā)病機制之一，與黏膜損傷程度有關(guān)。

有關(guān)H.pylori對細胞增殖作用的報道不一，大多數(shù)體外試驗顯示H.pylori抑制細胞增殖［11-12］，但多數(shù)人體內(nèi)胃黏膜細胞組織學(xué)研究顯示，H.pylori可促進細胞增殖［1-2，13-15］，H.pylori感染陽性胃炎或非潰瘍性消化不良患者的胃黏膜上皮細胞增殖比對照組顯著增高，根除 H.pylori感染后會導(dǎo)致細胞增殖的降低［8］。目前研究認為，胃黏膜上皮細胞的增殖是H.pylori感染的繼發(fā)性反應(yīng)。H.pylori感染時炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的細胞因子和氧自由基可能刺激胃黏膜上皮細胞的增殖;另一方面，由H.pylori感染直接導(dǎo)致的胃黏膜的損傷和凋亡更有可能導(dǎo)致胃上皮細胞的代償性增生［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori的感染率為75.00%，其中出血組為83.33%，潰瘍組為78.26%，胃炎組為69.70%，H.pylori感染率在出血組、潰瘍組及胃炎組相比較無明顯差異(P＞0.05)，但在出血組，H.pylori感染率仍然高于潰瘍組及胃炎組，說明H.pylori感染和阿司匹林均增加了上消化道出血的危險性，兩者在導(dǎo)致上消化道出血病變中可能起協(xié)同作用。此外，在阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變中，H.pylori感染陽性組的胃黏膜上皮組織Ki-67染色積分為2.275±1.511，陰性組胃黏膜上皮組織Ki-67染色積分為1.588±1.698，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。說明阿司匹林相關(guān)性胃黏膜病變組織中，胃黏膜上皮細胞增殖不僅與阿司匹林導(dǎo)致胃黏膜損傷有關(guān)，與H.pylori感染亦有一定關(guān)系，阿司匹林和H.pylori均參與了胃黏膜的損傷，導(dǎo)致了胃黏膜增殖。在臨床工作中，若H.pylori感染陽性患者，服用阿司匹林治療時，需根除H.pylori治療，以減少胃黏膜的損傷。

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