腺病毒介導(dǎo)siRNA抑制全反式維甲酸誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RARβ表達(dá)

畢楊，龔敏，何昀，張赟，陳潔，李廷玉

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 兒童營養(yǎng)研究中心 兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室，重慶 400014

全反式維甲酸 (All-trans retinoic acid，ATRA) 是目前公認(rèn)的能有效誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的重要因子，它是維生素A在體內(nèi)的重要活性代謝產(chǎn)物，多項研究證實ATRA及其信號通路廣泛參與了胚胎期和生后早期神經(jīng)細(xì)胞分化、軸向?qū)ΨQ生長等神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程[1]。ATRA主要通過細(xì)胞核膜上的維甲酸受體 (Retinoic acid receptor，RAR) 介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[2]。RARs包含由不同基因編碼的α、β與γ 3個亞型，其中RARβ是一種在神經(jīng)細(xì)胞特異表達(dá)的受體，對神經(jīng)元表型的決定和維持有重要作用[3]。前期結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells, MSCs) 中幾乎不表達(dá) RARβ，而 ATRA預(yù)處理可以增強RARβ的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成神經(jīng)分化[4]，提示RARβ可能是維甲酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與MSCs成神經(jīng)分化的重要因素。siRNA沉默技術(shù)是研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要技術(shù)方法[5]，本研究構(gòu)建并篩選出攜帶針對大鼠RARβ基因的siRNA重組腺病毒，感染 MSCs后能有效抑制ATRA誘導(dǎo)的 RARβ表達(dá)增高，為進(jìn)一步探討RARβ是否參與維甲酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控的MSCs成神經(jīng)分化作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

腺病毒穿梭質(zhì)粒pSES-HUS、攜帶腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-Easy1的大腸桿菌BJ5183 (美國芝加哥大學(xué)何通川教授饋贈)；大腸桿菌 DH5α、HEK293細(xì)胞 (本實驗室保存)；大鼠MSCs為本實驗室分離培養(yǎng)，內(nèi)切酶SfiⅠ、PmeⅠ、PacⅠ(Biolabs公司)；T4 DNA連接酶、RT-PCR試劑盒、PCR Premix、Real-time PCR Master Mix (TaKaRa公司)；DNA marker、質(zhì)粒抽提試劑盒(Promega公司)；LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 (HyClone公司)；兔抗大鼠RARβ多克隆抗體、兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (Neuron-specific enolase，NSE) 抗體 (Abcam 公司)；羊抗大鼠巢蛋白(Nestin) 抗體、小鼠抗大鼠 β-微管蛋白(β-tubulin, Tju1) 抗體、小鼠抗大鼠 β-肌動蛋白(β-actin) 抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗 (Santa Cruz公司)；Dylight488標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠、驢抗羊二抗 (Jackson Immunor Research公司)；PCR引物 (Invitrogen公司合成)；基因測序由重慶醫(yī)科大學(xué)感染病重點實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 pAd-siRARβ腺病毒載體的構(gòu)建

設(shè)計 4對大鼠 RARβ基因的 siRNA序列(表1)，體外退火 (10 mmol/ L各10 μL混合，100 ℃，10 min，自然冷卻至室溫) 成兩端有SfiⅠ酶切位點的雙鏈DNA，SfiⅠ酶切pSES-HUS質(zhì)粒，與退火片段16 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性篩選單克隆，抽提質(zhì)粒，PCR (反應(yīng)體系20 μL∶2 μL質(zhì)粒模板，330 mg/L siRNA反義鏈和 U6啟動子引物各0.5 μL，2×反應(yīng)液10 μL，加水至20 μL；PCR參數(shù)：94 ℃ 2 min ；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 2 min ) 鑒定后并送測序，獲得 4組 pSES-siRARβ質(zhì)粒。PmeⅠ酶切pSES-siRARβ質(zhì)粒將其線性化，純化后轉(zhuǎn)化入攜帶pAd-Easy1骨架質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，卡那霉素和鏈霉素篩選，PCR (引物及條件同前) 和以pAd-Easy1為對照的PacⅠ酶切鑒定獲得腺病毒質(zhì)粒pAd-siRARβ。

表1 大鼠RARβ的siRNA序列Table 1 Sequences of siRNA for rat RARβ

1.2.2 重組腺病毒在 HEK293細(xì)胞中包裝并感染大鼠MSCs

將 PacⅠ酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRARβ用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，每隔3 d在倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白(Red fluorescent protein, RFP) 的表達(dá)變化及細(xì)胞狀態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)10~14 d，離心收集漂浮及貼壁細(xì)胞，1 mL PBS重懸，-80 ℃/37 ℃反復(fù)凍融4次，離心取上清，反復(fù)感染HEK293細(xì)胞數(shù)次獲得高滴度病毒。計算病毒滴度公式：病毒滴度(PFU/mL) =RFP陽性細(xì)胞數(shù)×病毒液稀釋倍數(shù)(PFU) /稀釋后體積 (mL)。MSCs按2×105細(xì)胞/孔接種 6孔板中，用 10、20、40、80感染復(fù)數(shù)(MOI: 病毒顆粒/MSCs) 的腺病毒感染，48 h后在熒光顯微鏡下計數(shù)RFP陽性細(xì)胞百分率，計算病毒的最佳MOI。

1.2.3 Real-time PCR篩選4組siRNA對ATRA誘導(dǎo)的RARβ表達(dá)的抑制效率

MSCs按2×105細(xì)胞/孔接種6孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別用 4組 Ad-siRARβ重組腺病毒感染，同時設(shè)置空白對照組及Ad-RFP腺病毒對照組，病毒感染3 d后加入1 μmol/L ATRA處理24 h，提取各組細(xì)胞的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，用能特異擴增大鼠RARβ的引物 (表2) 進(jìn)行Real-time PCR擴增 (PCR反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA模板，330 mg/L引物各 0.5 μL，2×SYBR Green反應(yīng)液10 μL，加水至20 μL；PCR參數(shù)：94 ℃ 3 min ；94 ℃ 10 s，54 ℃ 20 s，72 ℃20 s，40個循環(huán)；溶解曲線 65 ℃ ~ 95℃ 每5 s增加0.5 ℃，讀板)，同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參平行管。將篩選出的有效果的 3組Ad-siRARβ腺病毒等摩爾比例混合設(shè)為pool組，同上方法檢測對 RARβ的抑制效果。后續(xù)實驗siRARβ組均為3種有效Ad-siRARβ腺病毒混合感染細(xì)胞。

表2 Real-time PCR引物Table 2 Primers for Real-time PCR

1.2.4 Western blotting及免疫熒光檢測siRARβ pool對ATRA誘導(dǎo)的MSCs的RARβ表達(dá)的抑制效果

在 6孔板中設(shè)置對照組、ATRA組、Ad-RFP+ATRA組及Ad-siRARβ pool+ATRA組，提取總蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每組蛋白上樣量一致，80 V轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1~2 h，加入抗RARβ抗體(1∶200) 或β-actin抗體 (1∶200)，4 ℃過夜；洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗 (1∶2000)，室溫30 min；ECL發(fā)光，用Image Pro Plus 6.0軟件分析灰度值。在24孔板中同上設(shè)置各組，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加500 μL甲醇/孔，-20 ℃固定15 min；5%牛血清白蛋白500 μL/孔，室溫封閉1 h；兔抗大鼠RARβ抗體 (1∶500稀釋于PBS) 4 ℃搖動孵育過夜；Dylight488標(biāo)記的羊抗兔二抗 (1∶1 000稀釋于PBS) 室溫?fù)u動孵育30 min；PBS 洗滌5 min，重復(fù)3次，立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察照相，Image J軟件測定熒光強度值。

1.2.5 Real-time PCR及免疫熒光檢測 siRARβ對ATRA誘導(dǎo)的MSCs神經(jīng)分化的影響

MSCs按2×105細(xì)胞/孔接種6孔板中，待細(xì)胞貼壁后用 Ad-siRARβ pool重組腺病毒感染，同時設(shè)置MSCs對照組、ATRA處理對照組及Ad-RFP腺病毒對照組，病毒感染3 d后加入1 μmol/L ATRA處理24 h，棄去完全培養(yǎng)基，D-hank’s液洗細(xì)胞2次，加入改良神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (Modified neuronal induction medium，MNM) (含2%二甲亞砜，200 μmol/L丁基羥基茴香醚，20 mmol/L KCl，1.6 mmol/L丙戊酸，8 μmol/L福斯高林，0.8 μmol/L氫化可的松，4 ng/L胰島素的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基) 誘導(dǎo)細(xì)胞24 h。提取各組細(xì)胞的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，Real-time PCR檢測特異性神經(jīng)標(biāo)志物 Nestin、NSE、微管相關(guān)蛋白 2 (Microtubule-associated protein 2, MAP-2)、Tau蛋白的表達(dá) (引物見表 2，方法同1.2.3)。在24孔板中同上設(shè)置各組，同1.2.4方法檢測神經(jīng)標(biāo)志物Nestin、NSE及Tju1的表達(dá)。實驗重復(fù)3次，每次隨機選取10個非重疊視野，計數(shù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pAd-siRARβ腺病毒載體的構(gòu)建

4組pSES-siRARβ質(zhì)粒經(jīng)上述引物PCR可擴出約300 bp的條帶，測序結(jié)果與所設(shè)計的siRNA序列完全一致。同源重組后的pAd-siRARβ質(zhì)粒PCR同樣可獲得約300 bp的條帶，PacⅠ酶切質(zhì)?？梢? 500 bp的特征性小片段和大于30 kb的大片段 (圖1)，表明重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRARβ構(gòu)建成功。

2.2 重組腺病毒在 HEK293細(xì)胞中包裝并感染大鼠MSCs

pAd-siRARβ質(zhì)粒經(jīng) PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，24 h可觀察到約10%~20%細(xì)胞有RFP的表達(dá)，10 d可見RFP陽性細(xì)胞呈現(xiàn)云霧狀聚集，細(xì)胞變圓有病毒空斑形成，待1/2以上細(xì)胞脫壁漂浮時收集病毒液，數(shù)次感染HEK293細(xì)胞，最終得到的4個重組腺病毒滴度在 (4.5×108~7.0×108) PFU/mL范圍。重組腺病毒感染大鼠MSCs的RFP陽性率在60%~70%時，MOI分別為20、20、40、20 (圖2)。

2.3 Real-time PCR篩選siRNA對RARβ表達(dá)的抑制效率

ATRA 處理可顯著增強 RARβ的表達(dá)16.5±2.34倍(P＜0.05)，4組 Ad-siRARβ處理后ATRA誘導(dǎo) MSCs的 RARβ表達(dá)量分別下降了(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%、(-19.1±1.24)%。將有抑制效果的前3組Ad-siRARβ混合為pool后，對RARβ的抑制效率明顯增強，表達(dá)量下降 (78.09±4.24)% (P＜0.01) (圖3)。

圖1 pAd-siRARβ腺病毒載體的構(gòu)建鑒定Fig. 1 Construction of four pairs of pAd-siRARβ adenovirus recombinant. M1: DNA marker1 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp; M2: λ /Hind III DNA marker 23 130 bp, 9 416 bp, 6 557 bp, 4 361 bp, 2 322 bp, 2 027 bp, 564 bp, 125 bp, 1: pSES-siRARβ 1 U6+site1 anti-sense PCR; 2: pSES-siRARβ 2 U6+site2 anti-sense PCR; 3: pSES-siRARβ 3 U6+site3 anti-sense PCR; 4: pSES-siRARβ 4 U6+site4 anti-sense PCR; 5: pAd-siRARβ 1 U6+site1 anti-sense PCR; 6: pAd-siRARβ 2 U6+site2 anti-sense PCR; 7: pAd-siRARβ 3 U6+site3 anti-sense PCR; 8: pAd-siRARβ 4 U6+site4 anti-sense PCR; 9: pAd-siRARβ 1 PacⅠ; 10: pAd-siRARβ 2 PacⅠ; 11: pAd-siRARβ 3 PacⅠ; 12: pAd-siRARβ 4 PacⅠ; 13: pAd-Easy1 PacⅠ.

圖2 Ad-siRARβ腺病毒在HEK293細(xì)胞中包裝及感染大鼠MSCs (以Ad-siRARβ 1為例)Fig. 2 Package of Ad-siRARβ in HEK293 cells and infection of rat MSCs (take Ad-siRARβ 1 as example). (A) pAdsiRARβ 1 transfected HEK293 cells at 1 d. (B) pAd-siRARβ 1 transfected HEK293 cells at 10 d. (C) Ad-siRARβ 1 infected MSCs at 2 d.

圖3 不同處理組RARβ的表達(dá)水平Fig. 3 The expression of RARβ in each treated groups. △: P<0.05 compared with control group; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ATRA group; **: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA group.

2.4 siRARβ可抑制 ATRA誘導(dǎo)的 MSCs RARβ表達(dá)增高

對照組MSCs中幾乎無RARβ表達(dá)，ATRA處理24 h后的MSCs有較強的RARβ蛋白表達(dá)，并定位于細(xì)胞核 (圖4、5)，Ad-RFP腺病毒感染不影響RARβ的表達(dá)及定位變化，Ad-siRARβ組ATRA誘導(dǎo)的RARβ表達(dá)明顯降低 (P＜0.05)。

2.5 siRARβ可抑制ATRA誘導(dǎo)的MSCs神經(jīng)分化

MSCs中僅有少量的Nestin表達(dá)，ATRA聯(lián)合MNM培養(yǎng)可誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)分化，分化24 h后表達(dá)Nestin、NSE、MAP-2及Tau特異性神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志 (圖7)，免疫熒光結(jié)果顯示Nestin、NSE、Tju1陽性細(xì)胞比例為 (50.37±5.01)%、(85.45±6.78)%、(88.02±15.37)% (表3)。siRARβ組相關(guān)神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)降低，Nestin、NSE、Tju1陽性細(xì)胞比例分別為 (38.94±4.26)%、(21.39±5.19)%、(27.79±6.54)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。提示腺病毒介導(dǎo)的siRARβ可顯著抑制ATRA+MNM誘導(dǎo)的MSCs神經(jīng)分化。

圖4 Western blotting檢測Ad-siRARβ對ATRA誘導(dǎo)的RARβ表達(dá)的抑制Fig. 4 Western blotting was performed to detect the inhibition efficiency of Ad-siRARβ to ATRA induced RARβ expression. 1: control group; 2: ATRA group; 3: Ad-RFP+ATRA group; 4: Ad-siRARβ+ATRA group. n=3; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ATRA group.

圖5 免疫熒光檢測各處理組RARβ定位及表達(dá)變化Fig. 5 Localization and expression change of RARβ in each group were detected by immunofluorescence (200×). n=5; *: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA group. (A) Immunofluorescence staining. (B) Immunofluorescence intensity.

圖6 不同誘導(dǎo)組神經(jīng)特異性標(biāo)志物的的表達(dá)水平Fig. 6 Expression of neural specific markers in each induced groups. n=3; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ ATRA+MNM group; **: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA+MNM group.

表3 免疫熒光檢測各神經(jīng)特異性標(biāo)志蛋白的陽性細(xì)胞比例(±s)Table 3 Positive expression ration of neural specific markers of induced neural cells by immunofluorescence (±s)

表3 免疫熒光檢測各神經(jīng)特異性標(biāo)志蛋白的陽性細(xì)胞比例(±s)Table 3 Positive expression ration of neural specific markers of induced neural cells by immunofluorescence (±s)

n=10; *: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA+MNM group.

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3 討論

全反式維甲酸在生物個體發(fā)育及維持正常生理狀態(tài)中有重要作用，可介導(dǎo)對細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[6]。ATRA也是誘導(dǎo)神經(jīng)板生成的重要生物活性物質(zhì)，能促進(jìn)多潛能神經(jīng)嵴前體細(xì)胞的生存、增殖及誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化[7]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新及跨胚層分化能力的成體干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)環(huán)境下可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，移植動物可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存活并分化為有一定功能的神經(jīng)樣細(xì)胞[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：ATRA預(yù)誘導(dǎo)可顯著提高M(jìn)SCs向神經(jīng)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及存活率[4]，并有效改善MSCs對新生大鼠缺氧缺血性腦病的移植治療效果[9]。

ATRA主要通過維甲酸受體RAR (包括α、β、γ 3個亞型) 介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]，其信號調(diào)控的多樣性取決于組織細(xì)胞類型、背景及維甲酸信號通路相關(guān)因子的表達(dá)狀態(tài)。ATRA可通過調(diào)控RAR亞型的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)管的發(fā)育缺陷，提示RAR的表達(dá)模式與神經(jīng)管的發(fā)育密切相關(guān)，其中RARβ表達(dá)的上調(diào)是實現(xiàn)神經(jīng)管后孔關(guān)閉的必要因素[11]。Goncalves MB等[12-13]發(fā)現(xiàn)RARα激活狀態(tài)下，神經(jīng)祖細(xì)胞主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而RARβ激動主要誘導(dǎo)神經(jīng)元的形成，并上調(diào)神經(jīng)發(fā)育重要轉(zhuǎn)錄因子islet-1/2的表達(dá)，提示RARα調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化，而RARβ決定神經(jīng)元表型。我們前期檢測到大鼠原代MSCs中RARα、RARγ有低水平的表達(dá)，而 RARβ幾乎不表達(dá)，MSCs神經(jīng)誘導(dǎo)過程中各RARs表達(dá)均有不同程度上調(diào)，細(xì)胞向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。而ATRA預(yù)誘導(dǎo)促進(jìn)MSCs向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，抑制膠質(zhì)細(xì)胞分化，經(jīng)不同濃度 (0.01、0.1、1 μmol/L) ATRA處理24 h后RARα、RARγ表達(dá)沒有變化，而RARβ表達(dá)顯著增高，且具有明顯的量效關(guān)系[3]。因此我們認(rèn)為ATRA可能通過上調(diào)RARβ激活維甲酸信號途徑，促進(jìn)MSCs向神經(jīng)方向分化及神經(jīng)元表型的決定。

為了證實這一假設(shè)，我們擬采用siRNA抑制ATRA處理后MSCs中RARβ的表達(dá)，以便進(jìn)一步研究RARβ對維甲酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促MSCs成神經(jīng)分化的影響及具體的分子機制。腺病毒介導(dǎo)siRNA表達(dá)是目前基因工程領(lǐng)域常用的技術(shù)手段[14]， 在本實驗中，我們選擇帶有U6和H1雙啟動子的siRNA構(gòu)建系統(tǒng)[15]，構(gòu)建了4組攜帶針對大鼠RARβ的siRNA腺病毒，感染MSCs能達(dá)到60%以上的高效率，并從中篩選出3組能有效抑制RARβ內(nèi)源性表達(dá)的siRNA。由于siRNA具有序列相似性，可能抑制其他具有相似位點的基因表達(dá)，為了盡可能地減少這種脫靶(off-target) 效應(yīng)[16]，我們采用混合池 (pooling)的策略，即用等比例的不同位點siRNA混合。因為3組siRNA均是針對RARβ這一靶基因，但是off-target的非特異性位點卻不一樣，從而減小了off-target幾率，而混合后siRNA的knockdown效率卻等同于、甚至超過單獨siRNA效率的加和[17]。我們的結(jié)果也顯示，pool組的抑制效率明顯高于各個單獨siRNA組。

隨后，我們檢測了siRARβ對MSCs神經(jīng)分化的影響。MSCs僅表達(dá)少量神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志Nestin，ATRA預(yù)誘導(dǎo)聯(lián)合MNM神經(jīng)誘導(dǎo)是本實驗室誘導(dǎo)MSCs體外神經(jīng)分化的成熟模型[18]，誘導(dǎo)后細(xì)胞折光性增強，并逐漸伸出突起，呈雙極或多極神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)元早期及特異性標(biāo)志蛋白 NSE、Tju1[19]，神經(jīng)元樹突標(biāo)志物MAP-2，神經(jīng)元軸突標(biāo)志物Tau蛋白[20]的表達(dá)顯著增高。siRARβ抑制RARβ的表達(dá)，從一定程度上阻斷了ATRA與RARβ結(jié)合后導(dǎo)致的維甲酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級聯(lián)放大反應(yīng)，減少了與目的基因啟動子區(qū)域的特異性 RAR順式作用元件(RARE) 結(jié)合，抑制神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。然而，我們發(fā)現(xiàn)siRARβ組ATRA聯(lián)合MNM誘導(dǎo)的神經(jīng)蛋白的表達(dá)水平，低于MNM單獨誘導(dǎo)，可能的原因在于腺病毒介導(dǎo)的siRARβ，不僅抑制了ATRA誘導(dǎo)的RARβ表達(dá)增高，在MSCs整個體外誘導(dǎo)過程中，包括 MNM神經(jīng)誘導(dǎo)階段，siRNA的knock-down效應(yīng)仍然有影響。因此，在后續(xù)的研究中，可能需要采用RARβ的特異性抑制劑LE135[21]，階段性地抑制RARβ活性。

本實驗成功構(gòu)建并篩選出了針對大鼠 RARβ的siRNA腺病毒，并在大鼠MSCs中證實其能有效抑制ATRA誘導(dǎo)的RARβ內(nèi)源性表達(dá)增高，同時抑制MSCs的體外神經(jīng)分化。為深入研究RARβ對維甲酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在MSCs成神經(jīng)分化中的作用及具體分子機制提供了重要的實驗基礎(chǔ)。

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