流感疫苗研制的新策略

劉志輝，姜濤，秦鄂德，冉多良，秦成峰

1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

流行性感冒，簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒 (特別是 A型流感病毒) 感染引起的一種急性呼吸道傳染病，嚴(yán)重危害人類健康。截止到目前為止共爆發(fā)4次全球性流感大流行，每次都給人類帶來(lái)了重大的損失，其中 1918年的西班牙流感大流行導(dǎo)致全球5 000萬(wàn)~1億人死亡。2009年暴發(fā)的甲型H1N1流感大流行蔓延至全球200余個(gè)國(guó)家和地區(qū)，確診的死亡病例近2萬(wàn)人[1]。另外，據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 估計(jì)，全球每年大約有10億人感染流感，重癥患者約為300~500萬(wàn)人，死亡病例超過(guò)30萬(wàn)人[2]。

流感病毒屬正粘病毒科成員，包括甲、乙和丙三種型別。其中甲型和乙型流感病毒是導(dǎo)致流感流行的主要病原體。流感病毒基因組為單股負(fù)鏈RNA，包含8個(gè)節(jié)段。依據(jù)病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白血凝素 (Hemagglutinin，HA) 和神經(jīng)氨酸酶(Heuraminidase，NA) 的抗原性，甲型流感病毒分為 16個(gè) H亞型 (H1-H16) 和 9個(gè) N亞型(N1-N9)。不同亞型的流感病毒株之間往往缺乏有效的交叉免疫保護(hù)。同時(shí)，甲型流感病毒易發(fā)生突變，在人群免疫壓力下，流感病毒的抗原性不斷發(fā)生變異，導(dǎo)致抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，從而逃避人體的免疫監(jiān)視。

目前臨床應(yīng)用的流感疫苗主要是三價(jià)滅活疫苗，其成分包括季節(jié)性H1N1和H3N2甲型流感病毒以及乙型流感病毒。早期的滅活全病毒疫苗副作用大且不適用于12歲以下兒童[3]。目前的流感滅活疫苗主要是裂解疫苗，它是由是WHO每年針對(duì)流感病毒流行狀況預(yù)測(cè)下一年流感的流行，從而提供疫苗參考毒株而制備的滅活裂解疫苗。其較滅活全病毒疫苗更為安全，副作用輕微，但只有當(dāng)病毒和疫苗毒株相匹配時(shí)，疫苗才能發(fā)揮保護(hù)功能，且其依靠雞胚生產(chǎn)，產(chǎn)能有限，特別是難以滿足全球性流感大流行時(shí)對(duì)疫苗的需求[4]。因此，研制針對(duì)多種流感亞型、安全高效，易于生產(chǎn)的新型廣譜疫苗成為當(dāng)前流感疫苗研究的熱點(diǎn)。以下對(duì)新型流感疫苗的研究策略進(jìn)行了綜述。

1 血凝素靶向修飾減毒策略

血凝素是流感病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)流感病毒吸附至宿主細(xì)胞表面時(shí)，血凝素 HA2亞基構(gòu)象發(fā)生改變，其氨基端的融合肽暴露，與內(nèi)涵體膜結(jié)合，從而介導(dǎo)流感病毒的內(nèi)吞[5]。因此，當(dāng)血凝素的HA0前體經(jīng)宿主蛋白酶裂解為HA1和HA2時(shí)，流感病毒方具有感染性。基于血凝素這一特性，Stech等建立了流感病毒血凝素靶向修飾減毒新策略[6]。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，Stech等對(duì)季節(jié)性H1N1甲型流感病毒A/WSN/33株的血凝素酶切位點(diǎn)進(jìn)行突變，用纈氨酸 (Val) 代替第343位的精氨酸 (Arg)，使血凝素的裂解由依賴于胰蛋白酶轉(zhuǎn)變?yōu)閲?yán)格地依賴于彈性蛋白酶(Elastase)。所獲得的病毒突變體，在彈性蛋白酶存在下，其體外生物學(xué)特征基本保持不變；當(dāng)感染人時(shí)，由于人體內(nèi)缺少?gòu)椥缘鞍酌?，因此突變病毒的毒力將顯著降低，而其免疫原性得以保留。在小鼠試驗(yàn)中，病毒突變體感染組，在感染后第3天的肺部病毒載量比野毒株組低4個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)，在小鼠的腦和心臟組織中也檢測(cè)不到病毒。當(dāng)以106FPU的劑量的突變體免疫小鼠，可誘導(dǎo)高水平的IgG抗體，并產(chǎn)生對(duì)野毒株完全的免疫保護(hù)。

Gabriel研究小組隨后將這一策略成功應(yīng)用在高致病性禽流感病毒疫苗的研制中[7]。H7N7禽流感病毒SC35M-PB2333T株的342位的精氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，同時(shí)339~341位的氨基酸被刪除。所獲得的禽流感病毒突變體在小鼠體內(nèi)顯示出同樣的減毒特征和良好的免疫原性。

為了觀察這一策略在流感病毒自然宿主中的作用，Masic等將該策略在豬流感病毒疫苗研究上進(jìn)行了嘗試[8]。H1N1亞型的豬流感病毒第345位的精氨酸分別突變?yōu)槔i氨酸和丙氨酸。如果在細(xì)胞培養(yǎng)體系加入彈性蛋白酶，所獲得的兩株突變體增殖活性與野生病毒相同；而未加入彈性蛋白酶時(shí)，突變體的增殖則嚴(yán)格受到限制。突變體在自然宿主豬中亦具有明顯的減毒特征。突變體病毒感染組的豬肺組織病毒滴度以及病理?yè)p傷均低于野生型病毒組。結(jié)果顯示，病毒接種后第5天，突變體組的豬肺部?jī)H有輕微的病變，且未檢測(cè)到病毒，而野毒株組的豬肺部病變組織將近30%，肺部病毒載量更達(dá)103.5~104.5TCID50/g。病毒突變體具有良好的免疫原性，免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其淋巴細(xì)胞和γ-IFN分泌細(xì)胞顯著增多。特異IgG和IgA抗體效價(jià)在免疫后第5天分別高達(dá)1∶1967和1∶2 209。此外，突變體病毒不僅可誘導(dǎo)對(duì)野生型病毒完全的免疫保護(hù)，也可產(chǎn)生針對(duì)H3N2亞型的豬流感病毒的部分交叉免疫保護(hù)[9]。

基于血凝素靶向修飾的流感病毒減毒途徑適用于所有亞型的流感病毒，并且其減毒病毒來(lái)源于同源的野生型病毒，避免了產(chǎn)生新的抗原重組體的風(fēng)險(xiǎn)，是非常具有應(yīng)用前景的構(gòu)建流感減毒疫苗的新策略。然而，目前已報(bào)道的靶向修飾策略仍不穩(wěn)定。Masic的研究也表明用Stech和Gabriel研究小組已經(jīng)成功的豬胰彈性蛋白酶(Porcine pancreatic elastase) 不能拯救出豬流感病毒減毒株，而只能用人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶(Human neutrophil elastase) 才能拯救出流感減毒病毒，拯救出的流感病毒在豬胰彈性蛋白酶(Porcine pancreatic elastase) 存在的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后測(cè)序發(fā)現(xiàn)344位裂解位點(diǎn)的氨基酸突變?yōu)楦彼?(Pro)[8]。我們?cè)趯?duì)新甲型 H1N1流感病毒進(jìn)行血凝素靶向修飾時(shí)則發(fā)現(xiàn)，在病毒拯救過(guò)程中其突變位點(diǎn)易突變?yōu)樵瓉?lái)的序列，且用豬胰彈性蛋白酶不能拯救出流感病毒突變體。由于對(duì)血凝素裂解過(guò)程的細(xì)節(jié)與機(jī)制仍不完全清楚，因此也很難分析發(fā)生回復(fù)突變的原因。顯然，深入了解和認(rèn)識(shí)血凝素結(jié)構(gòu)與功能是有效開(kāi)展血凝素靶向修飾減毒策略的重要前提。

2 流感病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒 (Virus-like particle，VLP) 疫苗是一類兼顧安全性與免疫原性的疫苗形式。與其他單一的蛋白或多肽形式的疫苗相比，VLP疫苗在結(jié)構(gòu)和蛋白組成上與病毒相似，可誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答。同時(shí) VLP疫苗不含病毒基因組，不具有感染性，安全性較好。目前已有多種VLP疫苗，例如乙型肝炎病毒和人乳頭瘤病毒VLP疫苗已被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[10]。

流感 VLP疫苗含有流感病毒的主要保護(hù)性抗原HA、NA及M結(jié)構(gòu)蛋白，可形成與流感病毒相似的空心顆粒。其制備方法是將流感病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因克隆至桿狀病毒等表達(dá)載體，在相應(yīng)的靶細(xì)胞中合成流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，裝配成病毒樣顆粒并以出芽的方式釋放至胞外，從而獲得流感VLP[11]。目前已經(jīng)報(bào)道的流感VLP表達(dá)系統(tǒng)包括重組牛痘病毒、重組DNA質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)和重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等[12]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，流感 VLP疫苗具有良好的免疫原性，并可誘導(dǎo)長(zhǎng)效的免疫保護(hù)。Kang等用 H5N1亞型流感病毒 A/VietNam1203/04株VLP免疫小鼠誘導(dǎo)的針對(duì)同源野毒株的免疫保護(hù)作用長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月[13]。在另一研究中，基于H1N1亞型流感病毒A/California/04/2009株的VLP疫苗免疫小鼠，不僅能誘導(dǎo)對(duì)野毒株完全的免疫保護(hù)，對(duì)季節(jié)性H1N1亞型流感病毒A/PR/8/1934株也可產(chǎn)生部分免疫保護(hù)[14]。

Novavax公司于2010年在18~64歲之間的健康人群中，對(duì)流感 VLP疫苗的安全性、耐受性及免疫保護(hù)效果進(jìn)行了評(píng)估[15]。臨床實(shí)驗(yàn)顯示流感 VLP疫苗具有良好的耐受性和安全性，在疫苗接種組出現(xiàn)不良反應(yīng)的種類、比例與對(duì)照組大致相同。VLP疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定的免疫保護(hù)作用。受試者分別接種5 μg、15 μg和45 μg劑量的流感VLP疫苗，2周后的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率 (血凝抑制滴度≥1∶40) 可達(dá)到64%、79%和85%。

流感 VLP疫苗已進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段，且表現(xiàn)出良好的免疫效果。流感病毒 VLP疫苗和傳統(tǒng)疫苗相比，其明顯的優(yōu)勢(shì)在于其生產(chǎn)不依賴于雞胚，而是基于培養(yǎng)細(xì)胞，這將能克服大流感流行時(shí)由于雞胚不足而使疫苗供應(yīng)短缺的問(wèn)題[11]，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3 MicroRNA介導(dǎo)的減毒新策略

microRNA (miRNA) 是一類進(jìn)化上保守的非編碼小分子 RNA，具有在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)的功能。miRNA與其靶序列的結(jié)合，可抑制其翻譯。如果在病毒基因組中插入宿主miRNA的靶序列，在病毒感染宿主細(xì)胞的復(fù)制增殖過(guò)程中，miRNA與病毒RNA上的靶序列結(jié)合，抑制病毒RNA的翻譯和病毒的增殖，從而導(dǎo)致減毒，這就是miRNA介導(dǎo)的病毒減毒策略。由于其基于機(jī)體中固有的miRNA與人工插入病毒基因組的靶序列互補(bǔ)而介導(dǎo)的翻譯抑制，所以此途徑適用于各種亞型流感病毒減毒株的構(gòu)建。該技術(shù)目前已在多種病毒減毒疫苗有成功嘗試，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒[16]、柯薩奇病毒[17]和水皰性口炎病毒[18]等。

miR-93是哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種miRNA，在人和鼠成纖維細(xì)胞中的表達(dá)是保守的。基于這一特征，Jasmine等通過(guò)點(diǎn)突變的方法在流感病毒核衣殼蛋白保守區(qū)引入miR-93靶序列，分別獲得H1N1和H5N1亞型流感病毒減毒株[19]。這些減毒株即使高滴度接種小鼠，仍不能使小鼠致病。同時(shí)，減毒株免疫原性良好，接種小術(shù)后可誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答，對(duì)野毒株的攻擊產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)。更重要的是，由于miR-93在雞胚中含量極低，減毒株在雞胚中的增殖不受抑制，其生長(zhǎng)特性與野毒株相同，因此仍能采用雞胚培養(yǎng)的方式大量制備。

4 廣譜流感疫苗

目前使用的流感疫苗均針對(duì)特定的流感毒株。疫苗毒株與流行的流感毒株相匹配時(shí)，其誘導(dǎo)的中和抗體才可產(chǎn)生免疫保護(hù)效果，反之則無(wú)法提供有效的免疫保護(hù)，因而流感疫苗的毒株組成要隨著流感流行株的改變而不斷做出相應(yīng)的調(diào)整。

值得注意的是很多研究都發(fā)現(xiàn)不同亞型和同亞型的流感病毒間確實(shí)存在交叉免疫保護(hù)作用，盡管交叉保護(hù)效果較差[20-21]。我們?cè)缦鹊难芯恳沧C實(shí)2009年新甲型H1N1流感大流行前，我國(guó)一定比例的老年人群同樣也已存在針對(duì)新型流感病毒交叉抗體[22]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性流感疫苗的多次加強(qiáng)免疫可提高交叉抗體的水平[23]。顯然，流感病毒存在一些保守的靶點(diǎn)，可誘導(dǎo)針對(duì)同一亞型和不同亞型流感病毒的免疫應(yīng)答，但以傳統(tǒng)流感疫苗的形式，無(wú)法有效發(fā)揮發(fā)揮其交叉保護(hù)效果。因此，一直以來(lái)，研究者不斷在嘗試尋找這些保守的靶點(diǎn)，探索新的策略研制廣譜流感疫苗，使其可對(duì)現(xiàn)在流行的毒株及新出現(xiàn)的流行株提供持續(xù)的交叉免疫保護(hù)。

流感病毒M2e蛋白 (即M2蛋白的胞外區(qū))氨基末端的24個(gè)氨基酸殘基非常保守，特別是末端2~9位的氨基酸殘基 (SLLTEVET) 在所有亞型的甲型流感病毒中均是保守的[24]。目前，已報(bào)道多種基于 M2e保守區(qū)的廣譜流感疫苗，這些疫苗可誘導(dǎo)針對(duì)多種亞型的流感病毒的保護(hù)性的免疫反應(yīng)，可降低小鼠肺部的病毒載量，并保護(hù)小鼠免受致死量流感病毒的攻擊[25]。

Song等采用H1N1亞型流感病毒A/PR/8/34株滅活疫苗與含有 M2e蛋白的病毒樣顆粒(M2-VLPs) 免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗M2特異抗體水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)顯著高于滅活疫苗單獨(dú)免疫組；對(duì)不同亞型的流感病毒可誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)作用[26]。免疫小鼠分別接種致死劑量的H3N2亞型、H5N1亞型和大流行H1N1亞型病毒株，均只有輕微的體重降低，鼠肺病毒載量也顯著低于未免疫組。

一期臨床研究已初步證實(shí)基于 M2e的廣譜流感疫苗是安全有效的[27]。結(jié)果顯示，M2e疫苗具有很好的免疫原性，可誘導(dǎo)高水平的特異抗體，尤其與佐劑聯(lián)合使用時(shí)，90%的疫苗接種者均產(chǎn)生特異抗體。此外，試驗(yàn)中并沒(méi)有觀察到對(duì)疫苗的不良反應(yīng)。因此，基于 M2e的疫苗有很大的潛力發(fā)展成為安全有效的流感疫苗。

除 M2e外，基于血凝素的廣譜流感疫苗也是目前流感疫苗研究的熱點(diǎn)。盡管流感病毒的血凝素有高度的變異性，但它仍包含一些保守序列。這些保守序列也是廣譜流感疫苗的潛在靶標(biāo)。例如，HA2的氨基末端融合肽的前11個(gè)殘基，在目前已知的所有甲型流感病毒中高度保守[28]。研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)HA2融合肽的特異性抗體可中和不同HA亞型的流感病毒，包括H5N1禽流感病毒和1918年H1N1流感病毒；免疫小鼠亦能誘導(dǎo)完全免疫保護(hù)[28-29]，這顯示出基于HA2保守位點(diǎn)廣譜流感疫苗良好的應(yīng)用前景。此外，在正常情況下，HA2的融合肽位于病毒表面蛋白內(nèi)部，無(wú)法暴露于外，難以誘導(dǎo)相應(yīng)的特異抗體[30]。Steel等將血凝素HA1亞單位切除，使HA2暴露。這種基于“去頭”HA2的DNA疫苗在小鼠上，可誘導(dǎo)針對(duì)多種亞型流感病毒的免疫保護(hù)作用。這為廣譜流感疫苗的研制提供了一種新的思路。

5 展望

流感病毒的典型特點(diǎn)在于其快速的突變和重組，導(dǎo)致其抗原性的不斷變異。不同流感病毒毒株之間的基因重組是不斷產(chǎn)生新的流感病毒株的主要原因之一，且有相當(dāng)部分的重組毒株或者其致病性和毒力升高，或者具有了跨種屬傳播的能力，這類新的重組病毒往往容易導(dǎo)致流感大流行的產(chǎn)生[31]。2009年新甲型 H1N1流感病毒就是由多種豬流感病毒重組進(jìn)化的結(jié)果[32]，而我們研究發(fā)現(xiàn)其與季節(jié)性H1N1流感病毒重組后在小鼠中致病性顯著增高。相關(guān)研究也證實(shí)新甲型H1N1與季節(jié)性H3N2和禽流感H9N2病毒的重組也可導(dǎo)致類似的毒力增強(qiáng)現(xiàn)象[31-33]。

面對(duì)不斷變異的流感病毒，傳統(tǒng)的疫苗以及疫苗工業(yè)愈來(lái)愈難以應(yīng)對(duì)。因此，從流感疫苗的實(shí)際需求出發(fā)，新型的流感疫苗應(yīng)至少滿足三方面的要求。首先是廣譜針對(duì)多種亞型流感病毒，尤其是對(duì)新出現(xiàn)的流感病毒提供免疫保護(hù)，這不僅在應(yīng)對(duì)流感大流行上具有重要意義，同時(shí)在疫苗生產(chǎn)上也將避免傳統(tǒng)流感疫苗經(jīng)常改變疫苗株的弊端，經(jīng)濟(jì)意義重大。其次是更為安全、高效，在不同人群中均可產(chǎn)生理想的預(yù)防效果；三是易于生產(chǎn)，基于雞胚的傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)方式效率差，產(chǎn)量低，極大局限了流感疫苗的接種率，也難以應(yīng)對(duì)流感大流行時(shí)疫苗生產(chǎn)的需要。

目前雖然各種新型流感疫苗蓬勃發(fā)展，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，但仍多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離臨床應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的路要走。近些年來(lái)，對(duì)流感病毒了解的不斷加深，特別是對(duì)病毒蛋白結(jié)構(gòu)與功能的明確，免疫和致病機(jī)制的逐漸闡明，為新型流感疫苗策略的探索提供了重要的依據(jù)。如何更進(jìn)一步地加深對(duì)流感病毒的認(rèn)識(shí)，以及基于新的研究發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)技術(shù)去探索疫苗新途徑與新策略，仍將是未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)流感疫苗研究中最為重要的挑戰(zhàn)。

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