建立NF-κB核轉(zhuǎn)位的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型

苑玉和，吳苗苗，劉 巖，胡金鳳，王宏旭，陳乃宏

(天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100052)

核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種廣泛表達(dá)并發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化等功能。因在最初發(fā)現(xiàn)的時(shí)候能與免疫球蛋白的輕鏈(κ鏈)增強(qiáng)子結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄激活活性而命名。因其能夠參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，以及細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的生理病理過(guò)程密切相關(guān)。目前對(duì)于NF-κB活性的檢測(cè)多通過(guò)免疫印跡、免疫熒光或報(bào)告基因的方法，但上述檢測(cè)方法中由于樣品的準(zhǔn)備過(guò)程比較繁瑣，而且樣品不易保存，更重要的是不能夠觀察活細(xì)胞的狀態(tài)，因此建立一種能夠快速、簡(jiǎn)易觀察NF-κB活性的方法對(duì)于NF-κB相關(guān)通路的研究具有重要的意義。本文將通過(guò)構(gòu)建NF-κB中的p65與綠色熒光蛋白的融合載體，轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞后，建立顯微鏡下直接觀察NF-κB核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞模型，對(duì)相關(guān)化合物的篩選與機(jī)制研究具有重要意義。

1 材料

BV-2(小膠質(zhì)細(xì)胞)、PC12(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心，菌株E.coli DH5α為本室保存;真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1來(lái)自Clontech公司。TRIzol購(gòu)自Amresco，TANScript M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自天根公司，Taq酶、dNTPs、核酸內(nèi)切酶XhoI、EcoRI和T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物有限公司和Biolab公司，RNase A、Hochest33342購(gòu)自Sigma公司，DNA MarkerⅡ購(gòu)自鼎國(guó)生物有限公司。核酸純化試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自威格拉斯生物有限公司。所有細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，實(shí)驗(yàn)耗材購(gòu)自Corning公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。共聚焦顯微鏡是Leica公司的TCS SP2。

2 方法

2.1 RT-PCR 取小鼠腦組織1 mg，生理鹽水洗2遍，加入TRIzol后，移入EP管中，加入氯仿，振蕩、靜置并離心，取上清;加入異丙醇，離心，棄上清;加入75%乙醇洗滌沉淀。晾干后加入DEPC H2O溶解，得到RNA。以獲得的mRNA為模板，Oligo(dT)16為引物，逆轉(zhuǎn)錄酶TIANScrip M-MLV合成第一鏈。以獲得的cDNA為模板，引物兩端加入XhoI/EcoRI

酶切位點(diǎn)，引物序列如下:正義鏈:5'CCGCTCGAGCTATGGACGATCTGTTTCCCCTC 3';反義鏈:5'CGGAATTCACCTTAGGAGCTGATCTGAC 3'。具體反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性60 s;58℃退火60 s;72℃延伸90 s;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。利用核酸提取試劑盒純化擴(kuò)增的基因片斷(方法參照說(shuō)明書(shū))。

2.2 pEGFP-C1-p65的構(gòu)建及鑒定 T4DNA連接酶連接經(jīng)XhoI/EcoRI消化后的基因片斷和載體，16℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素(Kan+)篩選得到的克隆經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒經(jīng)XhoI/EcoR酶切，獲得的陽(yáng)性克隆送測(cè)序。

2.3 pEGFP-C1-p65在不同細(xì)胞中的表達(dá) 利用試劑盒提取測(cè)序正確的質(zhì)粒，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將PC12或BV-2細(xì)胞接種至已包被的玻片或 confocal皿，24 h后利用LipofectimeTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h提取全細(xì)胞可溶性蛋白，通過(guò)Western blot方法確認(rèn)p65的表達(dá)。

2.4 GFP-p65在不同細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位的情況 按照“2.3”方法轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞和PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，BV-2細(xì)胞給予LPS(100 μg·L－1)，孵育8～24 h后，可直接通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 成功構(gòu)建pEGFP-C1-p65融合載體 提取Kana+篩選菌株的質(zhì)粒，電泳質(zhì)粒的XhoI/EcoRI酶切產(chǎn)物，在1 600 bp附近發(fā)現(xiàn)有特異性條帶，與PCR產(chǎn)物大小一致(Fig 1)。同時(shí)測(cè)序結(jié)果也表明鼠源p65基因片斷成功插入載體pEGFP-C1。

Fig 1 p65 recombinant vectors digested by XhoI/EcoRI

3.2 Western blot法檢測(cè)GFP-p65在BV-2細(xì)胞中的表達(dá)

過(guò)表達(dá)p65細(xì)胞株裂解的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，分別加入anti-p65和anti-GFP抗體進(jìn)行免疫印跡，在分子質(zhì)量90 ku均有特異性條帶。該條帶為GFP-p65融合蛋白，是轉(zhuǎn)染后表達(dá)的外源性蛋白，對(duì)照組(僅轉(zhuǎn)染pEGFP-C1)中在該分子質(zhì)量處則無(wú)明顯條帶;而作為內(nèi)參的β-actin的表達(dá)量是一致的(Fig 2)，由此表明模型組中p65的表達(dá)量明顯增加。

Fig 2 p65 expression increased in transgenic model

3.3 LPS能夠誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞中的p65發(fā)生核轉(zhuǎn)位 LPS是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，在免疫應(yīng)答研究中常被作為一種多克隆免疫激發(fā)劑來(lái)模擬機(jī)體免疫激發(fā)狀態(tài)，是研究炎癥反應(yīng)常用的試劑。研究發(fā)現(xiàn)(Fig3 A)轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1后，熒光蛋白在全細(xì)胞表達(dá)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-p65后熒光蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)未出現(xiàn)熒光蛋白。而給予LPS刺激轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-p65的BV-2細(xì)胞后，綠色熒光蛋白標(biāo)記的p65則發(fā)生核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象(Fig 3 B)。

Fig 3A GFP-p65 overexpressed in BV-2 cells

Fig 3B GFP-p65 in BV-2 cells translocated into nucleus when BV-2 cells were exposed to LPS

3.4 GFP-p65在PC12細(xì)胞中的表達(dá) NF-κB不僅作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)也能夠調(diào)控神經(jīng)元的存活與死亡。將pEGFP-C1-p65轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，GFP-p65融合蛋白在有的細(xì)胞中主要分布在胞質(zhì)中，而在有的細(xì)胞中同時(shí)分布與細(xì)胞核中(Fig 4)，這種分布形式不同于在BV-2細(xì)胞的表達(dá)，這表明p65在神經(jīng)元中表達(dá)的不均一性。

Fig 4 GFP-p65 overexpressed in PC12 cells

4 討論

NF-κB是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rel蛋白質(zhì)家族成員，包括5種:NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB和C-Bel。其中哺乳動(dòng)物最多見(jiàn)的NF-κB因子是由p50和 p65兩個(gè)多肽組成的異源二聚體，它在細(xì)胞內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，是最主要的可以被誘導(dǎo)的二聚體。在NF-κB的異源二聚體中，雖然兩種亞單位均能與DNA結(jié)合，但只有p65蛋白的C-末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，能直接作用于靶基因而激活轉(zhuǎn)錄。因此目前可通過(guò)檢測(cè)p65的表達(dá)、分布的改變?cè)u(píng)價(jià)NF-κB活性的變化。基于上述原理，本文通過(guò)PCR的方法獲得p65基因，與綠色熒光蛋白(GFP)的基因融合后，構(gòu)建能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的融合載體，通過(guò)綠色熒光蛋白的指示，在顯微鏡下直接觀察p65的表達(dá)與分布，尤其是核轉(zhuǎn)位的情況，由此可更直接觀察NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的變化。

靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB以非活性形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受炎癥、感染、損傷或應(yīng)激等刺激后激活NF-κB［1］，使NF-κB快速易位進(jìn)入核內(nèi)，與靶基因κB位點(diǎn)結(jié)合，迅速誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄［2］。NF-κB廣泛分布于幾乎所有的組織和細(xì)胞中，通過(guò)影響靶基因的表達(dá)調(diào)控而影響細(xì)胞的功能。由于調(diào)節(jié)靶基因的不同，因而NF-κB發(fā)揮的功能也明顯不同。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB同樣發(fā)揮著重要的作用，參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并與腦缺血、腦損傷等疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)［3－4］，因此有學(xué)者提出NF-κB可作為治療神經(jīng)退行性疾病的靶點(diǎn)［5］。

在免疫系統(tǒng)中能夠激活NF-κB的刺激在神經(jīng)系統(tǒng)中同樣能夠發(fā)揮作用。BV-2細(xì)胞是來(lái)源于小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞系，利用該細(xì)胞系能夠進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的相關(guān)研究。近幾年的研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與多種疾病關(guān)系密切，尤其與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分［6］。研究表明給予LPS刺激BV-2細(xì)胞，能夠激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路［7］，而在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)利用LPS刺激小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞，GFP-p65能夠發(fā)生核轉(zhuǎn)位的情況，由此表明觀察基于綠色熒光蛋白與p65融合蛋白的的核轉(zhuǎn)位情況，可研究膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB活性的改變，由此對(duì)神經(jīng)炎癥相關(guān)的問(wèn)題進(jìn)行研究。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB不僅能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的功能，同時(shí)對(duì)神經(jīng)元存活、死亡、分化及突觸可塑性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［8］。多種因素能夠調(diào)控在神經(jīng)元中NF-κB的活性，其中包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如NGF能夠通過(guò)受體激活NF-κB［9］，對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)調(diào)控突觸可塑性也具有重要的意義。

GFP-p65在PC12中表達(dá)，在不同的細(xì)胞中其亞細(xì)胞定位并不相同，在有的細(xì)胞中僅在胞質(zhì)中表達(dá)，而有的也同時(shí)存在于細(xì)胞核中，呈現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)的不均一現(xiàn)象。由此說(shuō)明對(duì)于同一種刺激，不同的細(xì)胞反應(yīng)并不完全相同，這可能與細(xì)胞所處的周期或狀態(tài)不同有關(guān)。

目前已成功建立p65轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，為以NF-κB為靶點(diǎn)的創(chuàng)新藥物研制提供了良好的研究平臺(tái)，同時(shí)基于NF-κB對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)功能及對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)功能，觀察GFP標(biāo)記的p65可對(duì)某些作用于神經(jīng)元的創(chuàng)新藥物的作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究。

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