人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)

陳曉青，楊 榮，張 磊，邱文洪，李 艷，黃 丹

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2.基礎(chǔ)部，湖北 武漢 430056)

人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1酪氨酸激酶的克隆與表達(dá)

陳曉青1，楊 榮2，張 磊2，邱文洪2，李 艷1，黃 丹1

(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2.基礎(chǔ)部，湖北 武漢 430056)

目的 克隆人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體1酪氨酸激酶(VEGFR1/Flt-1)基因，構(gòu)建其表達(dá)載體，為其應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，對(duì)可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(sVEGFR1/sFlt-1)胞外區(qū)前四個(gè)結(jié)構(gòu)域基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，亞克隆至pUCl8質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序后，建立其表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pSGL-gpp-F，并將其轉(zhuǎn)化至Streptomyces lividans TK24，獲得基因工程菌株pSGLgpp-F，對(duì)其培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGF及Western blot分析。結(jié)果 在信號(hào)肽gpp的引導(dǎo)下，sFlt-1在S.lividans中獲得成功分泌表達(dá)，且表達(dá)的sFlt-1具有和配基VEGF結(jié)合的生物學(xué)活性，但在信號(hào)肽vis的控制下，未獲成功表達(dá)。結(jié)論 sFlt-1經(jīng)分離提純后，可用于與抑制血管生成相關(guān)的疾病的研究，而利用重組sFlt-1建立VEGF拮抗劑篩選模型，對(duì)于從組合化學(xué)庫等天然來源的化合物中，提取高通量、大規(guī)模藥物的篩選提供了可能。

血管內(nèi)皮生長因子受體;基因表達(dá);酪氨酸激酶;克隆

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一個(gè)具有相似結(jié)構(gòu)的生長因子家族，其成員均屬于酪氨酸蛋白激酶，亦均屬于同源二聚體糖蛋白，如VEGF-A、B、C、D和胎盤生長因子(PIGF)［1］，以及如受體 R1(Flt1)、R2(KDR)、R3(Flt4)等，其家族成員均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速血管生成，增加血管通透性等功效，而血管生成參與了組織再生、傷口愈合、子宮內(nèi)膜周期性增生以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成等多種病理和生理過程。因此，VEGF在心血管、燒傷等學(xué)科具有廣闊的應(yīng)用前景［2］。

VEGF主要通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化，進(jìn)而增加微血管對(duì)大分子物質(zhì)的通透性，其介導(dǎo)的多途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中特異的膜受體而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VEGF受體1酪氨酸激酶(VEGFR1/Flt-1)作為其酪氨酸激酶受體，介導(dǎo)了血管形成過程中內(nèi)皮細(xì)胞的游走、組織因子的產(chǎn)生、滋養(yǎng)層細(xì)胞NO的釋放、以及VEGF刺激的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的游走。Flt-1胞內(nèi)域的酪氨酸激酶直接參與了VEGF與Flt-1結(jié)合后的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［3］。VEGFR1/Flt-1在血管生成中可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞之間以及內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)之間的作用，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞的遷移和血管成形的重要作用，本研究以此為切入點(diǎn)，就VEGFR1/Flt-1的克隆、表達(dá)和功能進(jìn)行探索，試圖為相關(guān)疾病的醫(yī)藥開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株 E.coli TG1:S.lividans TK24，從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞克隆獲得編碼Flt-1胞外區(qū)的前四個(gè)結(jié)構(gòu)域(sFlt-1)，觀察其在變鉛青鏈霉菌S.lividans TK24的分泌表達(dá)。

質(zhì)粒PUC18(用于測(cè)序)，本室保存;pSGLgpp(鏈霉菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，含PUC18及S.globisporus分泌信號(hào)肽gpp的最小復(fù)制區(qū))，本室自行構(gòu)建;pUW1216(鏈霉菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒)，本室保存;pBSC(含S.venezuelae分泌信號(hào)肽vis及其調(diào)控全序列)，本室保存。

1.2 工具酶和試劑

總RNA提取試劑盒，BioDev Tech公司;RTPCR試劑盒、DNA回收試劑盒，QLAGEN公司;限制性內(nèi)切酶，Promega公司;Tap DNA聚合酶及T4DNA連接酶，Sangon公司;小鼠抗人Flt-1單克隆抗體、小鼠抗人VEGF單克隆抗體，R＆D Sytem公司;酪氨酸蛋白激酶試劑盒，上海工碩生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G抗體，北京中山生物技術(shù)有限公司。

2 方法

利用RT-PCR技術(shù)獲得sVEGFR1/sFlt-1胞外區(qū)前四個(gè)結(jié)構(gòu)域基因片段，經(jīng)酶切后亞連接至測(cè)序質(zhì)粒PUC18，測(cè)序正確后構(gòu)建其表達(dá)載體pSGLgpp-F，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至鏈霉菌S.lividans TK24進(jìn)行原核表達(dá)，并用SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證。

PCR產(chǎn)物的純化、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)、DNA的連接、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、重組克隆篩選和質(zhì)粒抽提等技術(shù)均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南手冊(cè)》［4］進(jìn)行。

2.1 總RNA提取

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.2 擴(kuò)增目的基因片段

按照已知基因序列設(shè)計(jì)引物。上游引物P1:5'-GCGGAATTCTCCTGAACTGAGTTTAAAAGGC-3'，引入Eco RⅠ限制酶切位點(diǎn);下游引物 P2:5'-CAAAGCTTTCACTGGGGTTTCACATTGAC-3'，引 入終止密碼子TGA及HindⅢ限制酶切位點(diǎn)。以提取的總RNA為模板，45℃逆轉(zhuǎn)錄30 min后，進(jìn)行預(yù)變性，共35個(gè)循環(huán)，依次為94℃ 5 min，94℃ 2 min，66℃ 1 min，72℃ 1 min。而后再次進(jìn)行72℃延伸10 min?？傻玫綌U(kuò)增編碼Flt-1的核苷酸片段?；厥誇lt-1基因片段，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增，行瓊脂糖制備凝膠電泳。

2.3 pUC-F質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序

雙酶切Flt-1基因片段、pUC18分別經(jīng)Eco RⅠ和HindⅢ，使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的重組質(zhì)粒行DNA測(cè)序。

2.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒

雙酶切pUC-F用Eco RⅠ、HindⅢ，以及質(zhì)粒pSGLgpp，分別回收Flt-1片段、5.6 kb片段，并與已經(jīng)回收的Flt-1片段連接，轉(zhuǎn)化S.lividans TK24，提取重組子質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定;將Flt-1片段連接于pBSC質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBSC-F，經(jīng) Bam HⅠ和HindⅢ雙酶切后，獲得vsi-HindⅢ片段，連接經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒pUWL219，再轉(zhuǎn)化E.coli TG1，獲得重組質(zhì)粒 pUWL219-vis-F，將其轉(zhuǎn)化于 S.lividans TK24中。

2.5 SDS-PAGE

在YEME培養(yǎng)基5 mL中接種重組轉(zhuǎn)化子，置于28℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接種于CM培養(yǎng)基50 mL中，28℃培養(yǎng)72 h，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2.6 蛋白印跡受體配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)

將樣品在未煮沸的過程中加入不含二硫蘇糖醇的上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot轉(zhuǎn)移，完成后取下硝酸纖維素膜，加用含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液，4℃封閉過夜。而后使用纖維素膜經(jīng)TBS漂洗，用0.1 mL/cm2含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液、VEGF165溶液(1 mg/mL)10μL封袋，室溫緩慢震蕩3 h，TBS漂洗纖維素膜3次，5 min/次。

3 結(jié)果

3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及鑒定

在獲得的Flt-1基因片段之中插入pUC18質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示，在850和1 168 bp處擴(kuò)增的Flt-1基因均發(fā)生了相應(yīng)的氨基酸A→G 突變，即er→Gly、Thr→Ala，但由于突變位置為受體非結(jié)合區(qū)，因此不影響sFlt-1的生物學(xué)活性。

3.1.1 重組質(zhì)粒pSGLgpp-F的構(gòu)建鑒定 質(zhì)粒pSGLgpp-F經(jīng)Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切后，得到1.2 kb的片段，與Flt-1基因片段大小一致(圖1)。提示Flt-1基因插入了pSGLgpp-F質(zhì)粒，以pSGLgpp-F為模板進(jìn)行PCR，可得到1.2 kb片段，從而進(jìn)一步證明Flt-1基因插入了pSGLgpp質(zhì)粒。

圖1 重組質(zhì)粒pSGLgpp-F的Eco RⅠ/HindⅢ酶切鑒定

3.1.2 重組質(zhì)粒pUWL219-vsi-F的構(gòu)建鑒定 將Flt-1基因片段連接至pBSC質(zhì)粒，獲得pBSC-F(圖2)。pBSC-F經(jīng)Bam HⅠ和HindⅢ雙酶切后，獲得1.8 kb的片段vis-F，為vis序列(0.6 kb)和目的基因片段(1.2 kb)之和，提示目的基因片段插入了pBSC-F(圖3)。pBSC-F經(jīng)Bam HⅠ和HindⅢ雙酶切，得到相應(yīng)1.8 kb的片段vis-F，表明vis-F片段插入了PUWL219質(zhì)粒。

3.2重組蛋白的表達(dá)

3.2.1 SDS-PAGE 培養(yǎng)上清SDS-PAGE分析結(jié)果表明，與對(duì)照 S.lividans(pSGLgpp)相比，S.lividans(pSGLgpp-F)表達(dá)產(chǎn)物在63.6 kD處有明顯條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。而 S.lividans(pUWL219-vis-F)表達(dá)產(chǎn)物與對(duì)照S.lividans(pUWL219)相比，沒有明顯差別，表明Flt-1在S.lividans(pSGLgpp-F)中獲得了分泌表達(dá)，而在S.lividans(pUWL219-vis-F)中未檢測(cè)到表達(dá)。

3.2.2 Western blot 對(duì) S.lividans(pSGLgpp-F)的培養(yǎng)上清進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示在63.6 kD處出現(xiàn)特異性雜交條帶，因此確認(rèn)表達(dá)產(chǎn)物為Flt-1，表明Flt-1基因在 S.lividans(pSGLgpp-F)中獲得了分泌表達(dá)。

3.2.3 蛋白印跡受體配基結(jié)合實(shí)驗(yàn) 63.6 kD處出現(xiàn)特異性雜交條帶，提示表達(dá)產(chǎn)物sFlt-1具有與配基VEGF165相結(jié)合的生物學(xué)活性。

圖2 重組質(zhì)粒pBSC-F的Bam HⅠ/HindⅢ酶切鑒定

圖3 重組質(zhì)粒 pUWL219-vis-F的Bam HⅠ/HindⅢ酶切鑒定

4 討論

鏈霉菌作為新發(fā)展起來的原核表達(dá)系統(tǒng)，以其既具有的多種信號(hào)肽，能介導(dǎo)外源蛋白分泌表達(dá)，且又不會(huì)形成包涵體，從而使得蛋白處理工藝簡單化，使得外源蛋白大量降解等特點(diǎn)而成為實(shí)現(xiàn)宿主多種不同來源異源基因的表達(dá)研究中的熱點(diǎn)［5-6］，外源蛋白分泌表達(dá)能力的強(qiáng)弱與蛋白的類型、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、信號(hào)肽的選擇密切有關(guān)。本研究中采用兩種不同的分泌信號(hào)肽gpp和vis，其中g(shù)pp屬于S.globisporus產(chǎn)生的新型抗生素C1027輔基蛋白分泌信號(hào)肽，以期探索Flt-1基因在鏈霉菌S.lividans分泌表達(dá)的影響，研究中將其編碼序列引入鏈霉菌質(zhì)粒pSGLN，通過以自行構(gòu)建的鏈霉菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pSGpp為載體，成功表達(dá)了 VEGFR1/Flt-1。經(jīng)SDS-PAGE、Western blot分析以及受體-配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在gpp引導(dǎo)下，F(xiàn)lt-1在S.lividans中獲得成功表達(dá)，在vis的控制下，未獲成功表達(dá)。成功表達(dá)的Flt-1具有和配基VEGF結(jié)合的生物學(xué)活性。提示不同的信號(hào)肽對(duì)同一基因的表達(dá)作用各異。

同時(shí)，序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在850和1 168 bp處擴(kuò)增的Flt-1基因均發(fā)生了相應(yīng)地氨基酸A→G突變。已有研究證實(shí)，影響VEGF與Flt-1結(jié)合的重要因素為谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺，蛋白印跡配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了發(fā)生的兩個(gè)氨基酸突變對(duì)表達(dá)的sFlt-1的生物學(xué)活性并沒有影響。但sFlt-1在鏈霉菌中獲得了成功表達(dá)的產(chǎn)物與VEGF可特異性結(jié)合則表明其具有配基結(jié)合生物活性。

可見，sFlt-1可作為受體拮抗劑，可與天然的VEGFR形成競爭性結(jié)合VEGF，可使得VEGF生物學(xué)活性降低，導(dǎo)致血管生成受抑，其表達(dá)的sFlt-1經(jīng)分離提純后，可用于抑制與血管生成的相關(guān)疾病研究中;同時(shí)，利用重組sFlt-1建立VEGF拮抗劑篩選模型，對(duì)于從組合化學(xué)庫等天然來源的化合物中，提取高通量、大規(guī)模藥物的篩選提供了可能。

本研究首次在原核表達(dá)系統(tǒng)成功的基礎(chǔ)上，得到大量可溶的具有酶活性的Flt-1酪氨酸激酶融合蛋白，為高通量篩選尋找受體的抑制劑提供了模型。我們已采用此模型篩選得到了若干個(gè)有效抑制劑，為尋找抑制腫瘤血管生成的先導(dǎo)化合物提供技術(shù)支持。

［1］張乃哲.血管內(nèi)皮生長因子及其受體與臨床研究進(jìn)展［C］//2006年全國微循環(huán)與血液流變學(xué)暨分子生物學(xué)新進(jìn)展學(xué)術(shù)研討會(huì)專題學(xué)術(shù)報(bào)告論文集，2006.

［2］常 影，姜 新.簡述血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的研究進(jìn)展［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2010，18(6):65-67.

［3］莊書斐，葉其壯.血管內(nèi)皮生長因子受體1酪氨酸激酶的克隆、表達(dá)和功能［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào):英文版，2002:34-38.

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Cloning，expression and characterization of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Tyrosine Kinase

CHEN Xiao-qing1，YANG Rong2，ZHANG Lei2，QIU Wen-hong2，LI Yan1，HUANG Dan1
(1.Medical Experimental Center，2.Deparment of Basic Science，Medical School of Jianghan University，Wuhan 430056，China)

Q78

A

1005-1678(2012)05-0631-03

2012-06-20

陳曉青，女，本科，實(shí)驗(yàn)師。