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    酪氨酸酚裂解酶及其在L-酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用

    2012-08-15 00:48:20韋平和彭加平
    中國生化藥物雜志 2012年5期
    關(guān)鍵詞:丙酮酸多巴酶法

    韋平和,彭加平,營 佳

    (常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心,江蘇 常州 213164)

    酪氨酸酚裂解酶及其在L-酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用

    韋平和,彭加平,營 佳

    (常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心,江蘇 常州 213164)

    L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生產(chǎn)的少數(shù)氨基酸之一,應(yīng)用酶法取代水解法生產(chǎn)L-酪氨酸是近年來氨基酸工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。本文對酪氨酸酚裂解酶的結(jié)構(gòu)、機(jī)制及應(yīng)用進(jìn)行了綜述,為酶法生產(chǎn)L-酪氨酸及其衍生物提供參考。

    酪氨酸酚裂解酶;L-酪氨酸;合成;結(jié)構(gòu);機(jī)制

    酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL,EC 4.1.99.2),也稱β-酪氨酸酶,在生物體內(nèi)催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨,但在生物體外可將苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸[1],而L-酪氨酸常作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑、苯丙酮尿癥患者的必需氨基酸,以及L-多巴、黑色素、對羥基肉桂酸、對羥基苯乙烯等醫(yī)藥化工產(chǎn)品的制備原料。該酶主要分布于腸細(xì)菌內(nèi),也存在于一些嗜熱菌和節(jié)肢動物體中,其中酶活較高的微生物主要是草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)、中間檸檬酸菌(Citrobacter intermedius)、弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)以及嗜熱菌Symbiobacterium thermophilum和Symbiobacterium toebii等[2]。近年來,來源于上述微生物的 TPL,其空間結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制已得到較深入研究,并在工業(yè)化應(yīng)用方面取得重要進(jìn)展。

    1 TPL的結(jié)構(gòu)特征

    1.1 氨基酸組成

    C.freundii MT-10419 TPL 的結(jié)構(gòu)基因長 1 368 bp,編碼由456個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),與輔酶結(jié)合的氨基酸殘基是Lys257。E.intermedia FKU10N 和 E.herbicola AJ 2982 TPL同樣由456個氨基酸殘基組成,亞基相對分子質(zhì)量(Mr)分別為51 441和51 364,氨基酸序列同源性為90.6%。Lee等[3]報(bào)道,S.thermophilum 和 Symbiobacterium SP.SC-1 TPL由458個氨基酸殘基組成,結(jié)構(gòu)基因長1 374 bp,與輔酶結(jié)合的氨基酸殘基為Lys258,亞基Mr分別為52 269和52 196,氨基酸序列同源性為99.3%。

    1.2 輔酶和單價(jià)陽離子結(jié)合位點(diǎn)

    TPL由4個相同的亞基組成。Demidkina等[4]將每個亞基分成N-末端臂、小結(jié)構(gòu)域、大結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)域間的連接區(qū)等四個部分。TPL的催化活性需要磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)作為輔因子。每個亞基含有1個PLP結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)位于一個亞基大、小結(jié)構(gòu)域與結(jié)晶學(xué)相關(guān)的另一亞基大結(jié)構(gòu)域之間形成的深裂內(nèi)。TPL的催化活性還需要單價(jià)陽離子K+或NH4+作為激活劑。每個亞基含有1個K+結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)位于結(jié)晶學(xué)相關(guān)的二個亞基之間相聯(lián)系的界面上,具有穩(wěn)定催化二聚體的作用。K+的配位數(shù)為7,它們是一個亞基Gly52和Asn262的羧基氧、另一個結(jié)晶學(xué)相關(guān)亞基Glu69的主鏈羧基氧與側(cè)鏈羧基氧,以及三分子水。Phillips等[5]認(rèn)為,Lys256 緊鄰 PLP 結(jié)合位點(diǎn) Lys257,在單價(jià)陽離子結(jié)合位點(diǎn)的形成中具有關(guān)鍵作用。不同陽離子與配位體在距離上的微小差異,引起了活性部位構(gòu)象的細(xì)微改變,這可能是不同陽離子對TPL活性具有不同效應(yīng)的原因。

    1.3 不同pH條件下的構(gòu)象變化

    TPL催化L-酪氨酸裂解的最適 pH為8.2,pH 6.0時該酶基本沒有活性。一般認(rèn)為這種高、低pH情況下的酶活差異是由于p K a約為7.8的二種催化堿的質(zhì)子化引起的。Milic等[6]將晶體分別生長于 pH 6.0 和8.0 所得的 C.freundii脫輔基TPL結(jié)構(gòu)比較研究表明,pH 6.0時酶活的顯著降低可能是由于活性部位氨基酸殘基Tyr71、Arg381和Tyr291以及單價(jià)陽離子結(jié)合殘基Glu69的構(gòu)象變化引起的。pH 6.0時脫輔基TPL活性部位呈開放構(gòu)象,pH 8.0時卻存在開放和閉合二種構(gòu)象。相對于開放構(gòu)象,閉合構(gòu)象中的小結(jié)構(gòu)域剛性區(qū)域呈16°旋轉(zhuǎn)向大結(jié)構(gòu)域移動12?,致使小剛性區(qū)域 Phe36、Met391、Arg381、Arg404、Phe448 和 Phe449 的位置和構(gòu)象發(fā)生變化,從而關(guān)閉了活性部位裂。

    2 TPL的作用機(jī)理

    TPL催化的β-消除反應(yīng)機(jī)制主要包括以下步驟:酶活性部位Lys257的ε-氨基與PLP共價(jià)結(jié)合形成內(nèi)醛亞胺,內(nèi)醛亞胺與底物L(fēng)-酪氨酸作用形成外醛亞胺,Lys257奪取外醛亞胺(底物)Cα質(zhì)子產(chǎn)生醌型中間物,經(jīng)底物Cγ質(zhì)子化及Cβ-Cγ鍵斷裂生成α-氨基丙烯酸中間物,α-氨基丙烯酸中間物進(jìn)一步受與PLP結(jié)合的Lys257ε-氨基攻擊再生TPL全酶[7]。

    醌型中間物和Cβ-Cγ鍵斷裂是TPL催化β-消除反應(yīng)的中心和關(guān)鍵。醌型中間物相當(dāng)不穩(wěn)定,難以觀察其結(jié)構(gòu)及反應(yīng)過程中的構(gòu)象變化。Phillips等[8]用快速掃描停流分光光度法(rapid-scanning stopped-flow spectrophotometric method),在C.freundii TPL催化以 S-乙基-L-半胱氨酸為底物的反應(yīng)中,添加能選擇性結(jié)合并穩(wěn)定醌型中間物的苯酚類似物4-羥基吡啶(5 mmol/L),首次發(fā)現(xiàn)在338 nm處呈指示醌型中間物的新吸收峰。Milic等[9]對 C.freundii TPL催化以 L-甲硫氨酸為底物所形成的醌型中間物結(jié)構(gòu)及機(jī)制研究表明,TPL活性部位的部分閉合可能發(fā)生于外醛亞胺形成時期,而完全閉合發(fā)生于醌型中間物形成期間或隨后?;钚圆课坏拈]合可保護(hù)醌型中間物免于溶劑影響,而且能將具有重要催化作用的Arg381和Thr124移至合適位置,以便與醌型中間物和過渡態(tài)相互作用,進(jìn)而有利于酮-醌型中間物的形成以及隨后的苯酚消除。

    隨后,Milic等[10]對捕捉到的 Cβ-Cγ鍵斷裂前后中間物結(jié)晶快相(crystallographic snapshots)研究時發(fā)現(xiàn),活性部位處于開放構(gòu)象時醌型中間物呈松弛態(tài)(relaxed),活性部位閉合時醌型中間物被誘導(dǎo)而呈應(yīng)變態(tài)(strained),應(yīng)變態(tài)結(jié)構(gòu)主要依靠底物的酚羥基與Arg381、Thr124之間形成的氫鍵來維持穩(wěn)定。為了釋放這種緊張,應(yīng)變態(tài)醌型中間物更易于Cγ質(zhì)子化和Cβ-Cγ鍵的斷裂。Milic等推測,TPL催化的β-消除反應(yīng)后階段步驟,即酮-醌型中間物的形成及隨后的苯酚消除,不僅發(fā)生于閉合的活性部位內(nèi),而且醌型中間物受活性部位閉合的誘導(dǎo)發(fā)生應(yīng)變而有利于反應(yīng)的進(jìn)行。而且,在Cβ-Cγ鍵斷裂之后,活性部位又呈開放構(gòu)象,以便產(chǎn)物的釋放及與新的底物分子結(jié)合。因此,活性部位的閉合對于TPL發(fā)揮其催化活性具有關(guān)鍵作用。

    3 TPL在L-酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用

    TPL可用于生產(chǎn)L-多巴、L-酪氨酸及其衍生物。日本味之素(Ajinomoto)公司于1993年首先采用TPL生產(chǎn)L-多巴,其工藝是以E.herbicola TPL催化鄰苯二酚、丙酮酸和氨合成L-多巴,可積累 L-多巴110 g/L,并生產(chǎn)出將近世界年產(chǎn)量(250 噸)一半的 L-多巴[11]。但是,這一工藝需在E.herbicola的培養(yǎng)基中添加L-酪氨酸以誘導(dǎo)表達(dá)TPL,而L-酪氨酸和L-多巴理化性質(zhì)相近,從而造成分離純化困難和生產(chǎn)成本增加[12]。相關(guān)的重要進(jìn)展是 Koyanagi等[13]應(yīng)用 DNA改組技術(shù)篩選出攜帶突變型調(diào)節(jié)基因 TyrR的E.herbicola,其TPL在無L-酪氨酸誘導(dǎo)時可積累L-多巴11.1 g/(L·h),而野生型TPL在有L-酪氨酸誘導(dǎo)時僅為0.375 g/(L·h),生產(chǎn)率提高了30倍。用TPL生產(chǎn)L-多巴已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化20年,而用TPL合成L-酪氨酸尚處于研發(fā)中。

    3.1 用TPL合成L-酪氨酸的工藝路線

    L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生產(chǎn)的少數(shù)氨基酸之一,收率低,環(huán)境污染嚴(yán)重,應(yīng)用酶法取代水解法生產(chǎn)L-酪氨酸具有重要的應(yīng)用價(jià)值。用TPL合成L-酪氨酸,首先開展的工藝是丙酮酸路線。Para等將包埋于聚丙烯酰胺凝膠中的C.intermiedius固定化細(xì)胞作為催化劑,分批添加底物,建立75 mmol/L丙酮酸鈉、45 mmol/L硫酸銨、45 mmol/L氯化銨和55 mmol/L苯酚的轉(zhuǎn)化體系,反應(yīng)5 h后可積累L-酪氨酸10 g/L。若將反應(yīng)體系置于連續(xù)的柱反應(yīng)器內(nèi),苯酚對L-酪氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%,且穩(wěn)定性可維持5 d。其次是L-絲氨酸路線。由于L-絲氨酸可通過絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.2.1)催化甘氨酸和甲醛廉價(jià)制備,Lee等用產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)和E.herbicola ATCC 21434分別作為絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和TPL的酶源,將以甘氨酸為底物合成L-絲氨酸的反應(yīng)和以L-絲氨酸為底物合成L-酪氨酸的反應(yīng)相偶聯(lián),反應(yīng)體系含甘氨酸0.25 mol/L、PLP 0.5 mmol/L、四氫葉酸0.7 mmol/L、初始苯酚濃度0.32%,以37%甲醛啟動反應(yīng)16 h后,可產(chǎn)生L-酪氨酸26.3 g/L,甘氨酸轉(zhuǎn)化率為61.4%,但該工藝存在甘氨酸對TPL抑制較強(qiáng)和操作復(fù)雜的明顯不足。丙酮酸和L-絲氨酸對TPL均具有較高的Km值,需在反應(yīng)體系中過量加入,不僅導(dǎo)致產(chǎn)率降低,而且引起產(chǎn)物分離困難。S-鄰硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)是TPL適宜的人工底物,其Vmax比生理底物L(fēng)-酪氨酸高三倍,而Km僅為L-酪氨酸的50%。Phillips等以C.freundii ATCC 29063細(xì)胞懸液作為酶源,4 mmol/L SOPC和4 mmol/L苯酚反應(yīng)2 h,苯酚的轉(zhuǎn)化率就達(dá)到70%,而且這一反應(yīng)的最適pH較為寬泛(6.8~9.0)。不過,SOPC價(jià)格較高,從而限制了該工藝的工業(yè)化應(yīng)用[14]。

    3.2 用DNA改組技術(shù)提高TPL穩(wěn)定性

    上述丙酮酸、L-絲氨酸和SOPC三條工藝,均需添加另一底物苯酚,而苯酚能裂解細(xì)胞壁并使蛋白質(zhì)變性,故在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中一般采用固定化細(xì)胞形式和間歇添加方式來維持最低的苯酚濃度,以避免苯酚對TPL的抑制和失活作用。TPL存在于多種微生物體內(nèi),C.freundii等中溫菌TPL對苯酚的耐受性較差,而嗜熱菌TPL即使在高濃度苯酚條件下仍保持良好的穩(wěn)定性,因此近年來嗜熱菌TPL受到了人們的關(guān)注并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。Kim等[15]以S.toebii TPL為對象,應(yīng)用DNA改組技術(shù)從2萬個突變型TPL中篩選得到突變型A13V,這種TPL在76℃時仍保留60%催化活性,而野生型TPL下降到20%以下;在3 mol/L尿素情況下能顯示50%催化活性,而野生型TPL幾乎完全失去活性。Rha等[16]也對S.toebii TPL進(jìn)行了隨機(jī)突變和重新裝配并篩選得到7個突變型TPL,其催化活性平均增加了3倍,半失活溫度提高了11.2℃。Kim等[17]應(yīng)用具熱穩(wěn)定和化學(xué)穩(wěn)定的S.toebii TPL粗提液為催化劑,設(shè)計(jì)了一個用于L-酪氨酸合成的流加式反應(yīng)器系統(tǒng),該系統(tǒng)由1個2.5 L的反應(yīng)器和2個各0.5 L的底物貯罐組成,其中一個貯罐含2.2 mol/L苯酚和2.4 mol/L丙酮酸鈉,另一個貯罐含0.4 mmol/L PLP和4 mol/L氯化銨(pH 8.5),二貯罐內(nèi)的底物溶液通過蠕動泵連續(xù)地流加到反應(yīng)器中,并在反應(yīng)器的液面上空間充滿氮?dú)庖越档偷孜锏难趸饔?,?jīng)40℃反應(yīng)30 h可積累L-酪氨酸130 g/L,苯酚的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)94%。

    3.3 用TPL合成L-酪氨酸衍生物

    氮雜酪氨酸(aza-L-tyrosine)具有重要的潛在藥用價(jià)值,2-氮雜酪氨酸最初是從Streptomyces sp.中分離出的具抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物,3-氮雜酪氨酸也是從毒蘑菇Clitocybe acromelalga中分離出的天然產(chǎn)物。Watkins等[18]用來源于C.freundii的重組 TPL為催化劑,建立100 mmol/L氯化銨、0.162 mmol/L PLP、63 mmol/L 丙酮酸和 20 mmol/L 2-羥基吡啶的350 mL 反應(yīng)體系,pH 8.0 ~ 8.2、25 ℃反應(yīng) 5 d,可得純化的2-氮雜酪氨酸45.3 mg;若用3-羥基吡啶代替2-羥基吡啶,pH 8.8 ~ 9.0、37 ℃反應(yīng) 5 d,可得純化的 3-氮雜酪氨酸36.5 mg。Seisser等[19]為縮短 3-取代酪氨酸衍生物繁瑣的多步化學(xué)合成工藝,應(yīng)用定點(diǎn)突變拓寬C.freundii TPL這種C-C鍵形成酶的底物特異性,以獲得的突變型M379V TPL催化丙酮酸、氨和酚類化合物(鄰甲苯酚、鄰甲氧基苯酚和鄰氯苯酚)合成相應(yīng)的3-甲基、3-甲氧基和3-氯酪氨酸等L-酪氨酸衍生物,不僅只需一步反應(yīng),而且反應(yīng)完全、無副產(chǎn)物,對映體量大于97%。

    4 展望

    微生物酶法合成氨基酸,以其反應(yīng)周期短、選擇性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高、分離純化容易、所得產(chǎn)物均為L-型以及與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視,但天然的酶往往存在酶活不高、穩(wěn)定性不夠等缺陷,一定程度上限制了酶法工藝的推廣應(yīng)用。隨著對TPL結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入,應(yīng)用定點(diǎn)突變、DNA改組等蛋白質(zhì)工程技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,獲得更高的催化活性和穩(wěn)定性,將進(jìn)一步推動該酶在酶法生產(chǎn)L-酪氨酸及其衍生物中的工業(yè)化應(yīng)用。

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    Tyrosine phenol-lyase and its application in enzymatic synthesis of L-tyrosine

    WEI Ping-h(huán)e,PENG Jia-ping,Ying Jia
    (Applied Enzyme Engineering Technology R&D Center of Jiangsu,Changzhou Institute of Engineering Technology,Changzhou 213164,China)

    TQ464.8

    A

    1005-1678(2012)05-0695-03

    2012-04-06

    常州市科技支撐計(jì)劃(CE20115033);江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目

    韋平和,男,博士,副教授,從事生物活性物質(zhì)的酶法合成和發(fā)酵制備研究,Tel:0519-86332163,E-mail:phwei@email.czie.net。

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