響應(yīng)面法優(yōu)化硫酸軟骨素提取的酶解工藝

陳 亞，徐曉燕

(江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省鹽城技師學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

響應(yīng)面法優(yōu)化硫酸軟骨素提取的酶解工藝

陳 亞，徐曉燕

(江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省鹽城技師學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

目的 以豬喉軟骨為原料，提取硫酸軟骨素，優(yōu)化酶解工藝條件。方法 采用堿提-酶解-醇沉的方法提取硫酸軟骨素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解工藝。結(jié)果 酶解最佳工藝組合為:胰酶濃度1.0%、pH值8.6、酶解溫度46℃、酶解時(shí)間2.8 h。結(jié)論 采用上述組合，以氨基葡萄糖含量為指標(biāo)，氨基葡萄糖含量達(dá)25.94%。研究結(jié)果具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

硫酸軟骨素;提取;酶解;響應(yīng)面法;豬喉軟骨

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是具有硫酸基、羧基和乙酰基的一類糖胺聚糖［1］，廣泛存在于動物軟骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中，根據(jù)其硫酸基團(tuán)位置和數(shù)量的不同，分為硫酸軟骨素A、B、C、D、E等，其中最常見的是硫酸軟骨素A(CSA)和硫酸軟骨素C(CSC)。CS具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性［2-3］，我國生產(chǎn)的CS除滿足國內(nèi)需要外，年出口總量達(dá)到3 700噸，隨著各國對CS產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，國際上對高純度CS的需求量逐年增加［4］。

目前國內(nèi)主要以堿提-酶解-醇沉的方法制備CS［5-6］。由于CS在組織中以蛋白多糖的形式存在，其多糖鏈與核心蛋白通過共價(jià)鍵連接，該工藝中堿液提取的目的主要是破壞多糖鏈與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵，使蛋白多糖的糖肽鍵斷裂，從而將CS釋放出來;而酶解環(huán)節(jié)則是為了進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提高CS的純度，因而從整個生產(chǎn)流程看，堿液提取和酶解這兩步非常關(guān)鍵，它直接關(guān)系到CS的產(chǎn)率和質(zhì)量。本文以豬喉軟骨為原料，通過堿提-酶解-醇沉的方法制備CS，重點(diǎn)對酶解這一直接影響CS純度的關(guān)鍵步驟開展優(yōu)化研究，以期得到優(yōu)化的生產(chǎn)工藝。

1材料

新鮮豬喉軟骨，市售;胰酶(5 000 u/g)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;鹽酸氨基葡萄糖，南通雙林生物制品公司。

FA1604型電子天平，上海上天精密儀器有限公司;PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;SF-200型萬能粉碎機(jī)，泰州博精制藥機(jī)械有限公司;722型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

2方法

堿提-酶解-醇沉法制備CS的工藝流程為:原料預(yù)處理→堿液提取→酶解→去除雜質(zhì)→沉淀干燥→CS粗品。工藝中的原料預(yù)處理、堿液提取、去除雜質(zhì)、沉淀干燥等步驟參考文獻(xiàn)［5-6］。本研究重點(diǎn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析的方法，對酶解環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.1 單因素試驗(yàn)

對經(jīng)堿液提取后的提取液，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0～9.0，加入胰酶進(jìn)行酶解。根據(jù)影響酶促反應(yīng)的因素，分別對胰酶水解過程中的胰酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH值進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定單因素的最佳條件。

分別選取胰酶濃度 0.5%，0.7%，0.9%，1.1%，1.3% 和 1.5%，酶解時(shí)間為 2 h，酶解溫度45℃，pH值8.5時(shí)，考察胰酶濃度對 CS純度的影響。

當(dāng)胰酶濃度0.9%，酶解時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 和 3.5 h，酶解溫度 45 ℃，pH 值 8.5時(shí)，考察酶解時(shí)間對CS純度的影響。

當(dāng)胰酶濃度0.9%，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度分別為40，42，44，46，48 和 50 ℃，pH 值 8.5 時(shí)，考察酶解溫度對CS純度的影響。

當(dāng)胰酶濃度0.9%，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度46 ℃，pH 值分別為 7.9，8.1，8.3，8.5，8.7 和 8.9時(shí)，考察pH值對CS純度的影響。

2.2 響應(yīng)面法分析

利用響應(yīng)面法對酶解中影響CS純度的因素及因素間的交互影響進(jìn)行優(yōu)化，即根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［7-8］，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取胰酶濃度、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法分析影響胰酶水解的主次因素，得出該階段的最優(yōu)工藝條件。

2.3 CS 純度檢測

根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》［9］，CS純度以氨基葡萄糖含量為指標(biāo)。采用Elson-Morgan法測定氨基葡萄糖含量［9-11］。

2.3.1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 配制系列濃度的鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，加乙酰丙酮試液，沸水浴加熱5 min，冷卻后加無醛乙醇，60℃水浴加熱5 min，加對二甲氨基苯甲醛試液，60℃水浴加熱40 min，冷卻，測定在525 nm波長處的吸光度(A)值。以鹽酸氨基葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為:A=0.051 7 C+0.029 5，r=0.999 8。

2.3.2 樣品測定 取樣品約0.05 g，精密稱定，加入3 mol/L HCl溶液5 mL，沸水浴加熱60～80 min，冷卻，滴加20%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水至100 mL，過濾，取濾液按2.3.1項(xiàng)下方法操作，測定525 nm波長處的A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中的鹽酸氨基葡萄糖含量，經(jīng)換算得到樣品的 CS含量。

3 結(jié)果與討論

通過單因素試驗(yàn)，得到酶解中單因素的最佳條件:胰酶濃度為0.9%、酶解時(shí)間為3.0 h、酶解溫度為46℃、pH值為8.5，相應(yīng)的CS中氨基葡萄糖含量分別為 25.39%，25.63%，25.90%和 25.90%。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，確定酶解的最佳條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表1～2。將獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到氨基葡萄糖含量對胰酶濃度(A)、pH值(B)、酶解溫度(C)和酶解時(shí)間(D)的二次多項(xiàng)回歸方程:氨基葡萄糖含量Y=25.90+0.10A+0.39B+0.10C －0.017D+0.16AB+0.27AC －0.17AD －0.018BC+0.10BD －0.062CD －0.45A2－1.43B2－1.44C2－0.15D2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素編碼及水平Tab.1 Codes and levels of the response surfacemethodology

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，并對模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，模型P＜0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平;失擬項(xiàng) P=0.402 9＞0.05，不顯著，說明該模型擬合程度良好，可用于對酶解進(jìn)行分析和預(yù)測。此外，P值不但可用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ拖禂?shù)的顯著性，也可反映變量作用以及變量之間交互作用的大小，P值越小表示作用越顯著［12］。由表3可知，pH值對氨基葡萄糖含量的線性效應(yīng)顯著(P＜0.05)，胰酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間對氨基葡萄糖含量的影響不顯著;而胰酶濃度和酶解溫度兩者交互作用對氨基葡萄糖含量的影響較顯著，胰酶濃度和pH值、胰酶濃度和酶解時(shí)間、pH值和酶解溫度、pH值和酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用對氨基葡萄糖含量的影響不顯著。圖1為胰酶濃度和酶解溫度交互作用的響應(yīng)面分析圖及等高線圖，由圖2可知，在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，氨基葡萄糖含量隨著胰酶濃度的增加和酶解溫度的升高都是先提高后降低，響應(yīng)面圖呈鐘罩型，說明胰酶濃度和酶解溫度交互作用較顯著，這與表3的結(jié)果一致(表3交互項(xiàng)中AC的P值最小)。

表2 響應(yīng)面法分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The experimental design and results of the response surfacemethodology

表3 回歸模型的方差分析Tab.3 The variance analysis for the regression model established

圖1 胰酶濃度和酶解溫度對氨基葡萄糖含量影響的響應(yīng)面圖等高線圖Fig.1 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of the enzyme concentration and the temperature on the content of glucosamine

通過軟件Design-Expert 7.0求解回歸方程，得到氨基葡萄糖含量預(yù)測值最大時(shí)的因素水平為:胰酶濃度0.97%、pH 值 8.57、酶解溫度 46.22 ℃、酶解時(shí)間 2.80 h，氨基葡萄糖含量的預(yù)測值為25.97%?？紤]到實(shí)際操作，將實(shí)驗(yàn)條件修正為胰酶濃度1.0%、pH 值8.6、酶解溫度46℃、酶解時(shí)間2.8 h。在此條件下通過3次平行試驗(yàn)，測定實(shí)際氨基葡萄糖含量為25.94%，與預(yù)測值基本吻合，偏差較小，說明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對氨基葡萄糖含量的影響，證明該模型用于優(yōu)化CS提取過程中酶解工藝是可行的。

4結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立了從豬喉軟骨提取CS過程中酶解的胰酶濃度、pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間與CS純度(氨基葡萄糖含量)之間關(guān)系的二次多項(xiàng)回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型擬合程度高，準(zhǔn)確有效。優(yōu)化得到的最佳酶解工藝修正條件為胰酶濃度1.0%、pH值8.6、酶解溫度46℃、酶解時(shí)間2.8 h。此時(shí)獲得的CS，其實(shí)際氨基葡萄糖含量為25.94%，與預(yù)測值(25.97%)基本吻合，且高于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的豬軟骨組織來源的CS中氨基葡萄糖含量不得少于24.0%的標(biāo)準(zhǔn)［9］。表明響應(yīng)面法用于酶解工藝的優(yōu)化是可靠的，本研究可為CS生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］熊雙麗，李安林，金征宇.豬喉軟骨硫酸軟骨素體外超氧陰離子自由基清除機(jī)理探討［J］.食品科學(xué)，2008，29(2):362-365.

［2］徐傳屯，關(guān)瑞章，鄭 江，等.養(yǎng)殖鱘魚軟骨中硫酸軟骨素的優(yōu)化提取工藝研究［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(3):154-161.

［3］劉 武.硫酸軟骨素藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2008，17(8):64-66.

［4］張志斌.硫酸軟骨素生產(chǎn)新酶解法工藝［J］.河南化工，2010，27(4):98.

［5］許永安，陳守平，蘇金華，等.史氏鱘魚硫酸軟骨素的提取及抗腫瘤活性的研究［J］.上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，19(4):553-559.

［6］吳楓楠.堿-酶法提取硫酸軟骨素的工藝研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，20(1):81-83.

［7］王能強(qiáng)，趙維俊，梁 芳，等.聚乙烯醇降解酶產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化研究［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(6):1158-1163.

［8］Yana R，Lia S L，Chunga H S.Simultaneous quantification of 12 bioactive components of Ligusticum chuanxiong Hort.by high-performance liquid chromatography［J］.JPharm Biomed Anal，2005，37:87-95.

［9］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部第六冊(生化藥品第一分冊)［S］.1998:138-139.

［10］伍茂云，謝書伸，冉 蓉，等.硫酸軟骨素光度分析方法的改進(jìn)［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào):工程科學(xué)版，2000，32(3):101-102.

［11］于海洲，范慧紅，宋玉娟，等.硫酸軟骨素含量測定方法研究進(jìn)展［J］.中國生化藥物雜志，2011，32(2):160-162.

［12］ Hou X J，Chen W.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible BaChumushroom by response surface methodology［J］.Carbohyd Polym，2008，72(1):67-74.

Optim ization of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction by response surfacemethodology

CHEN Ya，XU Xiao-yan

(Jiangsu Key Laboratory of CoastalWetland Bioresources and Environmental Protection，Yancheng Technician College，Yancheng 224002，China)

Purpose The chondroitin sulfate was isolated from pig laryngeal cartilage.The technique of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction was improved.M ethods The chondroitin sulfate was isolated through the process of alkali extraction-enzymatic hydrolysis-alcohol precipitation。Based on the single factor tests，the technique of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction was improved by response surfacemethodology.Results To extract the chondroitin sulfate from pig laryngeal cartilage in enzymatic hydrolysis，the best combination of extracting technique was:the enzyme concentration of 1.0%，8.6 of pH，the temperature of 46 ℃，and the time of 2.8 h.Conclusion The content of glucosamine in the chondroitin sulfate was 25.94%after the optimization of the technique.The results can be calculated for industrial use.

chondroitin sulfate;extraction;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;pig laryngeal cartilage

R282.74;TQ464.1

:A

:1005-1678(2012)05-0548-04

2012-04-26

江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(JLCBE11006)

陳 亞，女，碩士，高級講師，主要從事生物醫(yī)藥、生物化工方面的研究，E-mail:ycjsxycy@sina.com。