亞麻下胚軸對卡那霉素及膦化麥黃酮的敏感濃度篩選

賈婉琪 郝冬梅 邱財(cái)生等

摘要：在亞麻（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ Ｌ．）高效再生體系建立的基礎(chǔ)上，以亞麻栽培品種派克斯（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｐａｘ）、中亞２號（Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｙａ Ｎｏ．２）和華星００９（Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｈｕａｘｉｎｇ ００９）為材料，研究了不同濃度的卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）和膦化麥黃酮（Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ，ＰＰＴ）對亞麻下胚軸分化和生長的影響。結(jié)果表明，在亞麻遺傳轉(zhuǎn)化早期選擇時，５０ ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ或１．５ ｍｇ／Ｌ的ＰＰＴ能夠完全抑制亞麻下胚軸的分化，是適宜的篩選濃度。

關(guān)鍵詞：亞麻；組織培養(yǎng)；遺傳轉(zhuǎn)化；卡那霉素；膦化麥黃酮

中圖分類號：Ｓ５６３．２；Ｓ５０３．５３文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3412-04

Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｖｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ

ｉｎ Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ L. Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ

ＪＩＡ Ｗａｎ－ｑｉ，ＨＡＯ Ｄｏｎｇ－ｍｅｉ，ＱＩＵ Ｃａｉ－ｓｈｅｎｇ，ＧＵＯ Ｙｕａｎ，ＤＥＮＧ Ｘｉｎ，ＬＯＮＧ Ｓｏｎｇ－ｈｕａ，

ＣＨＥＮ Ｘｉｎ－ｂｏ，ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｆｕ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ，the Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ （Ｋａｎ） ａｎｄ pｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ （ＰＰＴ ） ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ Ｌ． ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｐａｘ， Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｙａ Ｎｏ．２ ａｎｄ Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｈｕａｘｉｎｇ ００９ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ ｏｒ １．５ ｍｇ／Ｌ ＰＰＴ ｃｏｕｌｄ ｔｏｔａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｈｙｐｏｃｏｙｌ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． Ｉｔ ｗａｓ ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ Ｌ．； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； Ｋａｎａｍｙｃｉｎ； pｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ

亞麻（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ Ｌ．）是亞麻科亞麻屬一年生草本植物，也是農(nóng)業(yè)上古老的韌皮纖維作物和油料作物。早在５０００多年前古埃及就已經(jīng)開始種植亞麻，并用其纖維織布，現(xiàn)代從古墓中出土的木乃伊就是用亞麻布包裹的。亞麻纖維具有拉力強(qiáng)、細(xì)度好、柔軟、導(dǎo)電弱、吸水散水快、膨脹率大等特點(diǎn)，可紡高支紗，是制作高檔服裝的高級衣料，亞麻紡織品以其獨(dú)特的品質(zhì)深受廣大消費(fèi)者的青睞。但亞麻種子作為保健食品及醫(yī)藥原料的深度開發(fā)才剛剛開始，我國亞麻纖維又嚴(yán)重短缺，因此發(fā)展亞麻產(chǎn)業(yè)具有廣闊的前景。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸成為培育亞麻優(yōu)良品種的新途徑。近年來，亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化取得了一定的進(jìn)展［１－９］，如何從轉(zhuǎn)化群體中快速、有效地篩選出含有外源目的基因的轉(zhuǎn)化體是成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵。目前，應(yīng)用于亞麻的轉(zhuǎn)化體篩選方法包括抗生素篩選、除草劑篩選［１０，１１］、甘露糖（Ｍａｎｎｏｓｅ）篩選［１２］和β－葡萄糖苷酸酶（β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＧＵＳ）染色反應(yīng)篩選等數(shù)種，其中以抗生素篩選和除草劑篩選應(yīng)用最多。不同植物、不同外植體對篩選劑的敏感性不同，探討亞麻體細(xì)胞對篩選劑的最適篩選濃度對亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的意義。試驗(yàn)采用３個亞麻品種的下胚軸作為材料，研究其對卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）和除草劑的有效成分膦化麥黃酮（Pｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ，ＰＰＴ）的敏感性，以期為亞麻遺傳轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)和試驗(yàn)指導(dǎo)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１亞麻外植體的獲得供試亞麻品種為派克斯（Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｐａｘ）、中亞２號（Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｙａ Ｎｏ．２）、華星００９（Ｌ． ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ ｃｖ． Ｈｕａｘｉｎｇ ００９）。選擇飽滿度好、有光澤的亞麻種子，分別用７５％的乙醇浸泡３ ｍｉｎ，再用０．１％的升汞溶液浸泡４ ｍｉｎ，去離子水沖洗４遍，無菌濾紙稍微吸干后接種于ＭＳ（無激素添加）培養(yǎng)基上。２５ ℃±２ ℃條件下，先暗培養(yǎng)５ ｄ，再轉(zhuǎn)為每天１６ ｈ光照繼續(xù)培養(yǎng)３ ｄ。將萌發(fā)后的亞麻下胚軸部分切成０．５～０．８ ｃｍ長的小段，作為后續(xù)試驗(yàn)的外植體。

１．１．２篩選劑硫酸卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）購自北京鼎國生物有限公司；除草劑有效成分物膦化麥黃酮由捷克科學(xué)院植物分子生物學(xué)研究所惠贈。

１．１．３培養(yǎng)基①種子萌發(fā)培養(yǎng)基為ＭＳ（無激素添加）；②出愈和分化培養(yǎng)基為ＭＳ＋６－ＢＡ １ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０２ ｍｇ／Ｌ。以上培養(yǎng)基均添加３０ ｇ／Ｌ的蔗糖和７ ｇ／Ｌ的瓊脂，調(diào)節(jié)ｐＨ＝５．８，常規(guī)方法滅菌。

１．１．４試驗(yàn)方法先將準(zhǔn)備好的下胚軸切段置于無篩選劑的培養(yǎng)基②上進(jìn)行２ ｄ的恢復(fù)培養(yǎng)。再分別把所需質(zhì)量濃度的卡那霉素和膦化麥黃酮溶液經(jīng)０．２２ μｍ孔徑過濾器除菌后加入到滅好菌的培養(yǎng)基②中?？敲顾卦O(shè)５個濃度處理，分別是０ ｍｇ／Ｌ（ＣＫ１）、２５ ｍｇ／Ｌ（Ｋ１）、５０ ｍｇ／Ｌ（Ｋ２）、７５ ｍｇ／Ｌ（Ｋ３）、１００ ｍｇ／Ｌ（Ｋ４）；膦化麥黃酮設(shè)６個濃度處理，分別是０ ｍｇ／Ｌ（ＣＫ２）、０．２５ ｍｇ／Ｌ（Ｐ１）、０．５０ ｍｇ／Ｌ（Ｐ２）、１．００ ｍｇ／Ｌ（Ｐ３）、１．５０ ｍｇ／Ｌ（Ｐ４）、２．００ ｍｇ／Ｌ（Ｐ５）。每個培養(yǎng)皿中接種１０塊外植體，每處理設(shè)３次重復(fù)。外植體培養(yǎng)溫度為２５ ℃±２ ℃，每天光照１６ ｈ。兩周后更換一次新鮮培養(yǎng)基，調(diào)查記錄外植體生長情況。３５ ｄ后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

１．１．５數(shù)據(jù)處理培養(yǎng)一定時間后，統(tǒng)計(jì)各處理的不定芽分化率和外植體死亡率，不定芽分化率＝（分化出不定芽的外植體數(shù)÷接種的外植體總數(shù)）×１００％；外植體死亡率＝（死亡的外植體數(shù)÷接種的外植體總數(shù)）×１００％。

２結(jié)果與分析

２．１亞麻對卡那霉素的敏感性

卡那霉素是遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的篩選劑，主要是通過破壞植物的光合作用系統(tǒng)而達(dá)到選擇的目的。將預(yù)培養(yǎng)２ ｄ后的下胚軸外植體置于不同濃度梯度的卡那霉素培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，派克斯、中亞２號和華星００９ ３個亞麻品種對卡那霉素的反應(yīng)基本相同。培養(yǎng)３５ ｄ后各處理的分化率和死亡率結(jié)果見表１。從表１可見，卡那霉素對亞麻愈傷組織的生長和分化都有明顯的抑制作用，在不加卡那霉素的ＣＫ１培養(yǎng)基中，３個品種的亞麻下胚軸均能形成胚性愈傷組織，并分化出不定芽，愈傷膨大迅速，呈鮮綠色，不定芽健康且數(shù)量眾多（圖１）。

隨著卡那霉素濃度的升高以及培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織的生長受到明顯的抑制，體積增大速度減慢。２５ ｍｇ／Ｌ的卡那霉素處理就可對亞麻下胚軸不定芽的分化產(chǎn)生抑制作用，分化率明顯降低，即使分化出個別零星小芽，也大多為不健康的黃白色或黃褐色芽體，下胚軸體積增長速度明顯降低，培養(yǎng)35 ｄ的下胚軸體積與培養(yǎng)１４ ｄ的相比有小幅增加；當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到５０ ｍｇ／Ｌ時，亞麻下胚軸體積稍有膨大，但基本不能分化，培養(yǎng)３５ ｄ后死亡率達(dá)到９０％以上；卡那霉素濃度在7５ ｍｇ／Ｌ以上時，愈傷組織完全不能生長，亦不能分化出芽，下胚軸全部白化死亡。從表１的結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn)，雖然參試品種對卡那霉素的反應(yīng)基本相同，但５０ ｍｇ／Ｌ處理的派克斯和中亞２號還存在極少數(shù)分化與存活的組織，而華星００９已經(jīng)完全死亡，說明不同基因型外植體對卡那霉素的敏感性不同，試驗(yàn)選取的３個品種中，華星００９對卡那霉素最為敏感。因此在采用下胚軸作為亞麻遺傳轉(zhuǎn)化的外植體時，卡那霉素適合的篩選濃度約為５０ ｍｇ／Ｌ。

２．２亞麻對膦化麥黃酮的敏感性

膦化麥黃酮是有機(jī)磷類除草劑的有效成分，如其是非選擇性、廣譜除草劑草丁膦（Ｂａｓｔａ）的活性成分。谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）是植物中惟一的解毒酶，膦化麥黃酮強(qiáng)烈抑制了植物體內(nèi)ＧＳ的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的大量積累，最終導(dǎo)致植物體死亡［１３］。試驗(yàn)將恢復(fù)培養(yǎng)２ｄ后的下胚軸接種到含不同濃度膦化麥黃酮的培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，派克斯、中亞２號和華星００９對膦化麥黃酮的反應(yīng)基本相同。培養(yǎng)３５ ｄ后各處理的分化率和死亡率結(jié)果見表２。從表２可見，膦化麥黃酮對亞麻下胚軸愈傷組織的生長和分化都有抑制作用，當(dāng)膦化麥黃酮濃度在０．２５ ｍｇ／Ｌ時抑制作用不明顯，外植體愈傷組織塊生長旺盛，體積膨大，依然可以分化出鮮綠色的健康叢生芽，但與對照相比分化率有所降低；從０．５０ ｍｇ／Ｌ開始，愈傷組織的生長量減少，體積逐漸變小，外植體顏色暗淡，出現(xiàn)褐色壞死組織（圖２），不定芽分化率與對照相比有顯著降低，分化出的不定芽極小且呈黃綠色，外植體的死亡率也大幅增加，其中對華星００９的影響最為明顯；當(dāng)膦化麥黃酮濃度達(dá)１．００ ｍｇ／Ｌ時，雖然還有零星不定芽分化，但愈傷組織大部分都已褐化死亡；膦化麥黃酮濃度達(dá)到１．５０ ｍｇ／Ｌ以上時，只在外植體兩端切口處形成少量的黃褐色愈傷，且皺縮壞死，下胚軸中間部分干枯白化，外植體整體死亡。在３個參試品種中，對膦化麥黃酮最為敏感的品種仍然是華星００９，當(dāng)膦化麥黃酮濃度達(dá)到１．００ ｍｇ／Ｌ時，華星００９就已無法分化出不定芽；對膦化麥黃酮最不敏感的品種是中亞２號，派克斯和華星００９在１．５０ ｍｇ／Ｌ的膦化麥黃酮處理下就完全死亡，而中亞２號還有極少數(shù)的存活。因此，在采用下胚軸作為亞麻遺傳轉(zhuǎn)化的外植體時，膦化麥黃酮適合的篩選濃度約為１．５０ ｍｇ／Ｌ。

２．３亞麻下胚軸對卡那霉素與膦化麥黃酮的不同表現(xiàn)

由圖１和圖２可以看出，卡那霉素作用于亞麻的主要表現(xiàn)是使下胚軸整體不能生長且呈黃白色或黃褐色，亞麻對卡那霉素十分敏感，添加少量的卡那霉素（２５ ｍｇ／Ｌ），外植體體積就顯著小于對照；膦化麥黃酮作用于亞麻后，使下胚軸中間部分白化干枯，在切口兩端膨大形成褐化愈傷且壞死，表現(xiàn)出了一定的極性?？傮w來看，膦化麥黃酮作用后的下胚軸體積較卡那霉素作用后的大，外植體的顏色、性狀和生理狀態(tài)也不盡相同，這可能與兩種篩選劑的作用機(jī)理不同有關(guān)。但二者在亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化中都能起到良好的篩選作用。

３討論

在亞麻的基因轉(zhuǎn)化中，如何使用適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)記準(zhǔn)確、有效地區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，是轉(zhuǎn)化成功的重要環(huán)節(jié)之一。下胚軸是亞麻組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的外植體，卡那霉素和膦化麥黃酮又是最常使用的篩選劑。因此，了解亞麻下胚軸對這兩種篩選劑的敏感性是十分必要的。試驗(yàn)通過研究派克斯、中亞２號和華星００９這３個亞麻品種的下胚軸在含不同濃度的卡那霉素和膦化麥黃酮的培養(yǎng)基中的反應(yīng)，確定了它們的篩選濃度，為亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)提供了依據(jù)。

試驗(yàn)證明，卡那霉素和膦化麥黃酮對亞麻愈傷組織的誘導(dǎo)分化均有強(qiáng)烈的抑制作用，不利于亞麻的正常生長。高濃度下，亞麻下胚軸不能形成愈傷組織、不定芽，甚至完全死亡。雖然理論上篩選劑濃度越高選擇效率也越高，但過高則會影響組織細(xì)胞的生長，反而不利于篩選。在亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，卡那霉素濃度在５０ ｍｇ／Ｌ、膦化麥黃酮濃度在１．５ ｍｇ／Ｌ時就能夠抑制９０％以上的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長分化，是適宜的早期篩選濃度。此外，不同的基因型對篩選劑的敏感性也不同，試驗(yàn)中華星００９與其他兩個品種相比，對篩選劑具有更高的敏感度。因此，本試驗(yàn)的研究結(jié)果為供試亞麻品種的遺傳轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)操作依據(jù)，這可為大部分亞麻品種提供篩選劑濃度范圍，但具體的使用濃度還要根據(jù)不同基因型和不同生長階段進(jìn)一步確定。

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