Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的構(gòu)建

張凌云，石 晶，滕月娥，張 曄，曲秀娟，劉云鵬

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001)

Cbl是在哺乳類動物體內(nèi)廣泛分布的細(xì)胞內(nèi)蛋白，有C-Cbl、Cbl-b和 Cbl-c 3種。Cbl家族分子中含有多個不同的結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)不同的細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合，在細(xì)胞活化過程中可作為接頭分子或支架分子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo);同時該分子中的RING finger結(jié)構(gòu)域能夠與泛素結(jié)合酶 E2結(jié)合，作為泛素連接酶E3促進(jìn)其結(jié)合的靶分子發(fā)生泛素—蛋白酶體降解，因此參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控機(jī)制［1，2］。近年來許多研究表明，Cbl家族RING finger結(jié)構(gòu)域突變與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)［3～6］，但 Cbl家族分子對腫瘤細(xì)胞生長、遷移及多藥耐藥等方面的調(diào)控作用及分子機(jī)制尚不清楚。2010年6月～2011年4月我們進(jìn)行本研究，擬構(gòu)建靶向Cbl-b基因的短發(fā)夾環(huán)RNA(shRNA)真核質(zhì)粒表達(dá)載體，建立 Cbl-b shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，為探討Cbl-b的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長于含10%胎牛血清、12 U/ml慶大霉素的L-15培養(yǎng)基(Gibco)中。于37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。大腸桿菌菌株DH5α由本實驗室保存。

1.2 試劑與抗體 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購于 Invitrogen公司;dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DL2000 DNA Marker購自Takara公司;質(zhì)粒提取和DNA回收試劑盒由Qiagen公司提供;抗Cbl-b抗體、抗Actin抗體及HRP標(biāo)記的羊抗鼠、兔二抗均購于Santa Cruz Biotechnology公司。測序服務(wù)由Takara公司提供。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)Cbl-b基因序列，通過軟件設(shè)計兩個靶序列，利用BLAST進(jìn)行同源性分析，設(shè)計出1組Cbl-b shRNA序列及1組對照靶序列。引物序列Cbl-b(852 bp):5'-GATCCCGTTTCCGGTTAAGTTGCACTCGTTCAAGAGACGAGTGCAACTTAACCGGAAATTTTTTCCAAA-3'及5'-AGCTTTTGGAAAAAATTTCCGGTTAAGTTGCACTCGTCTCTTGAACGAGTGCAACTTAACCGGAAAGG-3'，引物序列空白對照:5'-GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTGATATCCGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCCAAA-3'及5'-AGCTTTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCGGATATCZAACGTGACACGTTCGGAGAACGG-3'。shRNA排列順序均為:BamHⅠ酶切位點+反義序列+loop+正義序列+TC+HindⅢ和BamHⅠ酶切位點+正義序列+loop+反義序列+AG+HindⅢ。

1.3.2 構(gòu)建靶向Cbl-b基因的shRNA真核質(zhì)粒表達(dá)載體 選用pRNA-U6.1/Neo作為載體?；瘜W(xué)合成法合成shRNA序列，將配對的單鏈合成雙鏈，采用Bam-HⅠ/HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，以T4連接酶連接于同樣經(jīng)過采用Bam-HⅠ/HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后的pRNA-U6.1/Neo載體內(nèi)。將構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌DH5α中，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，篩選陽性菌落。對構(gòu)建完畢的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，測序確認(rèn)后進(jìn)行大量復(fù)制、擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。

1.3.3 基因轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞。將對數(shù)生長期的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h，按5×105/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)85% ～95%時按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行脂質(zhì)法轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h換為含G418(2 mg/ml)、10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液，每2～3 d換液。有限稀釋法篩選2周后抗性克隆集落長出，挑取單克隆集落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.4 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Cbl-b的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞蛋白，取40 μg處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1 h，一抗孵育1 h，TBST洗膜后二抗孵育30 min，TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液，孵育5 min，暗室中用X片曝光、顯影、定影。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞系作為對照，選取表達(dá)率為對照組10%以下的細(xì)胞株為陽性細(xì)胞株。

2 結(jié)果

2.1 靶向Cbl-b基因shRNA真核質(zhì)粒表達(dá)載體的鑒定 將DNA測序結(jié)果和GenBank公布的人Cbl-b序列比對，結(jié)果顯示Cbl-b shRNA和空白對照模板成功構(gòu)建于 pRNA-U6.1/Neo載體上，序列完全正確，與目的序列相同。

2.2 空白對照組和Cbl-b基因沉默乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞系篩選 Western blot結(jié)果表明在27株陽性克隆MDA-MB-231/Cbl-b shRNA細(xì)胞中，7、9、18號克隆細(xì)胞株Cbl-b表達(dá)水平明顯低于空載體對照組，且18號克隆表達(dá)最低。Cbl-b基因沉默細(xì)胞系建系成功。見圖1。

圖1 Western blot檢測Cbl-b表達(dá)

3 討論

泛素—蛋白酶體途徑介導(dǎo)的蛋白降解是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能的一個重要機(jī)制。最近研究發(fā)現(xiàn)，泛素—蛋白酶體途徑與腫瘤相關(guān)性脫調(diào)控有關(guān)，參與腫瘤轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展、免疫監(jiān)控逃逸及抗藥性等真核細(xì)胞的許多代謝過程［4，5］。在此過程中需要3種酶的參與，即泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3。Cbl家族是泛素—蛋白酶體通路中的一種泛素連接酶E3，成員包括C-Cbl、Cbl-b和Cbl-c，可通過特異性選擇底物蛋白，啟動泛素化降解途徑而參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控。其中C-Cbl與Cbl-b結(jié)構(gòu)上具有79%的同源性，功能相似。C-Cbl及Cbl分子中含有多個不同的結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)不同的分子結(jié)合，靶向降解以EGFR為代表的一系列具有酪氨酸激酶活性的受體蛋白，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。目前 Cbl-b 已知的靶蛋白有 c-kit、EGFR、c-met、syk、Lyn、Grb2、P85 等［1，6］。但關(guān)于 Cbl-b 在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面的研究很少，因此需要進(jìn)一步深入研究Cbl-b對腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。

目前RNA干擾(RNAi)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為高效、特異阻斷細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)的有效工具。與其他制備siRNA的方法，如體外轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法等比較，真核干擾表達(dá)載體既經(jīng)濟(jì)高效又可以進(jìn)行長期穩(wěn)定的研究。本研究用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的Cbl-b基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，通過G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)干擾質(zhì)粒的細(xì)胞株。該細(xì)胞系的建立為首次報道，這為我們進(jìn)一步研究Cbl-b對乳腺腫瘤細(xì)胞生長、遷移等的影響，探討腫瘤治療的新思路奠定了基礎(chǔ)。

［1］Thien CB，Langdon WY.c-Cbl and Cbl-b ubiquitin ligases:substrate diversity and the negative regulation of signalling responses［J］.Biochem J，2005，391(2):153-166.

［2］Huang F，Gu H.Negative regulation of lymphocyte development and function by the Cbl family of proteins［J］.Immunol Rev，2008，224:229-238.

［3］Makishima H，Cazzolli H，Szpurka H，et al.Mutations of E3 ubiquitin ligase Cbl family members constitute a novel common pathogenic lesion in myeloid malignancies［J］.J Clin Oncol，2009，27(36):6109-6116.

［4］Qu X，Liu Y，Ma Y，et al.Up-regulation of the Cbl family of ubiquitin ligases is involved in ATRA and bufalin-induced cell adhesion but not cell differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，367(1):183-189.

［5］Zhang Y，Qu X，Hu X，et al.Reversal of P-glycoprotein-mediated multi-drug resistance by the E3 ubiquitin ligase Cbl-b in human gastric adenocarcinoma cells［J］.J Pathol，2009，218(2):248-255.

［6］Huang C.Roles of E3 ubiquitin ligases in cell adhesion and migration［J］.Cell Adh Migr，2010，4(1):10-18.