CAV1基因沉默增強MCF-7多細胞球對多柔比星的敏感性

顧棟樺 平金良 董吉順 朱榮 陳琦

1. 浙江省湖州市中心醫(yī)院病理科，浙江 湖州 313000；2. 復旦大學上海醫(yī)學院病理學系，上海 200032

腫瘤化療耐藥是導致腫瘤治療失敗的重要原因，因此深入了解腫瘤耐藥的機制是提高腫瘤臨床化療療效的重要基礎。細胞質膜微囊蛋白-1 (caveolin-1，CAV1)是細胞質膜微囊的主要功能蛋白，能與細胞膜上許多生物活性蛋白結合并調節(jié)細胞的生命活動，也與腫瘤細胞的耐藥相關［1-2］。本研究以體外三維培養(yǎng)的MCF-7多細胞球作為模型，運用RNA干擾技術沉默CAV1基因的表達，觀察MCF-7多細胞球對多柔比星耐藥性，并對其機制作初步的探討。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌MCF-7細胞單層培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細胞株購于中國科學院細胞資源中心，細胞在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)培養(yǎng)。

1.2 MCF-7多細胞球模型的建立

按細胞三維培養(yǎng)方法(liquid overlay technique)獲得MCF-7多細胞球：首先用無血清培養(yǎng)液RPMI-1640溶解稀釋瓊脂糖至1.5%濃度，滅菌后在細胞培養(yǎng)皿上鋪一淺層，冷卻凝固后用于細胞接種；單層貼壁培養(yǎng)的MCF-7細胞處于生長對數(shù)期時，用胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞密度至5×105/mL接種于上述培養(yǎng)皿中，輕輕震蕩后置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中，每24 h半量換液，相差顯微鏡觀察多細胞球生長情況，培養(yǎng)3 d后形成大小較一致的MCS，直徑約100～150 μm，用于實驗。

1.3 RNA干擾CAV1 mRNA的表達

特異針對CAV1基因及非特異性陰性對照雙鏈小RNA(siRNA)購于美國Santa Cruz公司，轉染方法按試劑說明書進行：MCF-7細胞生長于6孔板至60%～70%匯合，用無血清培養(yǎng)液靜置24 h，5 μL siRNA與5 μL RNA干擾轉染試劑(Santa Cruz公司，美國)混合于190 μL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，靜置30 min后滴加到培養(yǎng)皿中，溫育6 h后，添加10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)溫育24 h，棄去培養(yǎng)液重新用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，小心消化細胞成單細胞懸液，再按上述三維培養(yǎng)的方法得到多細胞球用于實驗。

1.4 細胞生長抑制率的檢測

單層MCF-7細胞消化制成單細胞懸液，調整細胞密度，接種于24孔板中；三維培養(yǎng)的細胞先取部分多細胞球吹散成單細胞懸液，細胞計數(shù)，然后按與單層培養(yǎng)細胞相同的細胞密度接種于1.5%瓊脂糖鋪底的24孔板中；各組細胞接種6 h后用終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1及10 μmol/L的多柔比星(海正藥業(yè)有限公司，浙江)作用24 h，以無多柔比星的細胞培養(yǎng)液作為陰性對照；細胞經(jīng)胰酶消化后吹散成單細胞懸液，與等體積0.02%臺盼藍混合，顯微鏡不同視野計數(shù)300個細胞及活細胞數(shù)。細胞生長抑制率=(1-多柔比星作用組活細胞數(shù)/陰性對照組活細胞數(shù))×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.5 RT-PCR檢測

Trizol試劑(生工生物工程有限公司，上海)提取細胞總RNA，cDNA合成按M-MLV逆轉錄酶(Invitrogen公司，美國)操作說明書進行，PCR擴增CAV1 mRNA，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)作為內(nèi)參照，引物由Primer 5.0軟件設計，上海生工生物工程有限公司合成，CAV1引物：上游引物5’-ACATCTCTACACCGTTCCCAT-3’，下游引物5’-TGTGTGTCCCTTCTGGTTCTG-3’，產(chǎn)物長度206 bp；GAPDH引物：上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，產(chǎn)物長度208 bp；反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，26個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。Taq酶為美國Promega公司產(chǎn)品，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離后，溴乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.6 蛋白免疫印跡檢測

收集細胞，經(jīng)PBS清洗后，加入細胞裂解緩沖液，提取總蛋白，蛋白定量按BCA試劑盒(Pierce公司，美國)說明書進行。根據(jù)蛋白相對分子量選用合適濃度的膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完畢，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入相應的一抗，37 ℃溫育1 h，洗滌后加入過氧化物酶標記的二抗，37 ℃溫育1 h ，最后用ECL法試劑盒(Pierce公司，美國)按產(chǎn)品說明書步驟顯色。條帶用Pro Analyzer 4.0軟件進行積分吸光度(IA)分析，以β-actin作為內(nèi)參。一抗：兔抗人caveolin-1多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，工作濃度1∶1 000；鼠抗人Phospho-FAK (Tyr397)及FAK單克隆抗體(BD Bioscience公司，美國)，工作濃度1∶1 000；鼠抗人β-actin單克隆抗體(Sigma公司)，工作濃度1∶1 000；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠及兔的IgG9(鼎國公司，上海)，工作濃度1∶2 000，實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 多細胞球形成增強MCF-7細胞對多柔比星的耐受能力

MCF-7細胞在體外三維培養(yǎng)3 d后形成直徑約100 μm、較為致密的多細胞球體(圖1A)。用不同濃度的多柔比星作用24 h，結果顯示0.001、0.01 μmol/L多柔比星作用時，單層細胞組與多細胞球組的細胞抑制率差異沒有統(tǒng)計學意義；隨著藥物濃度的增加，0.1、1及10 μmol/L多柔比星作用時，多細胞球組的細胞抑制率分別為單層細胞組的36.01%(t=9.72，P＜0.01)、46.75%(t=8.27，P＜0.01)和53.92%(t=7.01，P＜0.01)，組間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義 (圖2)。

2.2 多細胞球形成對CAV1表達及FAK磷酸化水平的影響

MCF-7細胞形成多細胞球后，CAV1 mRNA及蛋白水平與單層細胞相比差異無統(tǒng)計學意義，總FAK蛋白水平未見明顯改變，但磷酸化FAK(p-FAK)蛋白水平上調(圖3)；多細胞球組FAK相對磷酸化水平(p-FAK/總FAK)為單層細胞組的3.64倍(t=7.32，P＜0.01)。

圖1 MCF-7細胞三維培養(yǎng)3 d后形成的多細胞球體Fig.1 MCF-7 multicellular spheroids after 3-day 3D culture(×200)

圖2 不同濃度的多柔比星處理24 h后的細胞抑制率Fig.2 Cell inhibitory rate after treatment with ADM at different concentrations for 24 h

圖3 免疫印跡法檢測蛋白水平Fig.3 Level of proteins expression assessed by Western blot

2.3 RNA干擾CAV1基因效率的鑒定

用脂質體法轉染siRNA能明顯抑制MCF-7細胞CAV1基因表達，RT-PCR擴增26個循環(huán)后未檢測到CAV1 mRNA產(chǎn)物條帶；轉染組與未轉染組相比，轉染組CAV1蛋白水平下降67.6%(t=14.19，P＜0.01)；與RNA干擾對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 RNA干擾CAV1基因后的鑒定Fig.4 Effects of siRNA on the expression of CAV1 in both mRNA and proteins

2.4 RNA干擾CAV1基因降低多細胞球多柔比星耐藥性

RNA干擾CAV1基因表達后，MCF-7細胞之間相互黏附能力下降，三維培養(yǎng)3 d后形成的多細胞球較小并且松散，球體增長緩慢(圖1B)。用1 μmol/L的多柔比星作用24 h，單層細胞組細胞抑制率明顯高于未轉染多細胞球組(t=10.01，P＜0.01)；與未轉染組多細胞球相比，干擾組多細胞球的細胞抑制率增加了1.07倍(t=5.77，P＜0.01)，干擾對照組未見明顯改變(圖5)。

2.5 RNA干擾CAV1基因降低FAK磷酸化水平

免疫印跡法檢測結果顯示，與未轉染組多細胞球相比，RNA干擾組多細胞球總FAK蛋白水平未見明顯變化，p-FAK蛋白水平明顯下降，相對磷酸化水平下降68.7%(t=6.57，P＜0.01)，RNA干擾對照組未見明顯差異(圖3)。

圖5 多柔比星(1 μmol/L)處理24 h后的細胞抑制率Fig.5 Cell inhibitory rate after treatment with ADM (1 μmol/L) for 24 h

3 討 論

體內(nèi)存在的實體腫瘤是一個三維的多細胞群體，細胞與細胞、細胞與外基質的相互作用以及腫瘤的微環(huán)境因素都會影響腫瘤的生物學特性。因此，三維培養(yǎng)的多細胞球比單層培養(yǎng)的細胞更接近于腫瘤的真實狀態(tài)。目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞形成多細胞球后，對多種化療藥物的敏感性降低，而這種耐受能力的增強不是由于藥物不易進入到球體內(nèi)所致，這種耐藥現(xiàn)象被稱為“多細胞耐藥(multicellular resistance，MCR)”［3］。MCR現(xiàn)象在許多研究中被證實，例如卵巢癌［4］、結腸癌［5］及肺癌［6］等，其機制還不清楚，可能與細胞黏附分子及相關通路的激活有關［3］。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一個多功能的非受體型酪氨酸激酶，在細胞之間及細胞與基質黏附中起關鍵的作用，F(xiàn)AK及下游信號通路的激活可以促進腫瘤細胞的生長和侵襲［7］。陳玉英等［5］用RNA干擾方法沉默F(xiàn)AK基因，發(fā)現(xiàn)可以下調Akt/NF-kB通路的活性水平，從而逆轉大腸癌細胞的MCR現(xiàn)象，說明FAK在MCR的形成中起著重要的作用。

本研究成功建立了乳腺癌MCF-7細胞三維培養(yǎng)模型，比較多柔比星對單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的MCF-7細胞的抑制率，結果顯示多細胞球組對多柔比星的敏感性明顯下降。通過免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，雖然總FAK在形成多細胞球后沒有明顯改變，但FAK的磷酸化水平顯著增加，提示FAK激活可能是MCF-7多細胞球耐藥性增強的重要機制。

細胞質膜微囊是細胞膜上燒瓶樣的小凹結構，聚集著許多信號轉導相關蛋白，作為一個信號分子調節(jié)平臺，一方面起著募集蛋白的作用，使它們之間更容易發(fā)生相互作用；另一方面也把各種蛋白隔離開來，使它們在特定的條件下才被激活，從而使細胞生命活動協(xié)調有序的進行，CAV1蛋白在其中扮演著非常重要的角色［2］。CAV1在腫瘤細胞黏附和相關信號通路中起著調節(jié)作用，可以穩(wěn)定FAK的活性［8-9］。另外，不少研究發(fā)現(xiàn)CAV1在許多耐藥的腫瘤細胞系中表達增強，說明CAV1可能與腫瘤耐藥相關［2］。本研究用雙鏈小RNA干擾的方法有效沉默了MCF-7細胞CAV1基因的表達后，細胞之間的黏附能力明顯下降，形成的細胞球小而且松散，球體增長緩慢；FAK的相對磷酸化水平被抑制；MCF-7多細胞球對多柔比星的耐藥性發(fā)生了很大程度上的逆轉。但與單層細胞相比，多細胞球中CAV1無論在mRNA水平還是蛋白水平上都未見明顯改變。因此，研究推測CAV1在MCF-7多細胞耐藥的形成中起著細胞間黏附及相關信號通路調節(jié)平臺的作用，干擾CAV1基因的表達可以影響耐藥相關信號通路的活性，逆轉多細胞球的耐藥表型，其具體的機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究結果表明，多細胞球的形成可以增強MCF-7細胞對多柔比星的耐受性；RNA干擾CAV1基因的表達可以逆轉MCF-7多細胞球對多柔比星的耐藥現(xiàn)象，F(xiàn)AK磷酸化水平的下調可能是其重要的機制。

［1］ TIRADO O M, MACCARTHY C M, FATIMA N, et al.Caveolin-1 promotes resistance to chemotherapy-induced apoptosis in Ewing’s sarcoma cells by modulating PKC alpha phosphorylation ［J］. Int J Cancer, 2010, 126(2)： 426-436.

［2］ GOETZ J G, LAJOIE P, WISEMAN S M, et al. Caveolin-1 in tumor progression： the good, the bad and the ugly ［J］.Cancer Metast Rev, 2008, 27(4)： 715-735.

［3］ 鄭晨宏, 梁后杰, 周琪. 黏附分子在腫瘤多細胞耐藥中的研究進展 ［J］. 腫瘤, 2008, 28(07)： 626-629.

［4］ XING H, WANG S, HU K, et al. Effect of the cyclindependent kinases inhibitor p27 on resistance of ovarian cancer multicellular spheroids to anticancer chemotherapy［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2005, 131(8)： 511-519.

［5］ CHEN Y, WANG Z, CHANG P, et al. The effect of focal adhesion kinase gene silencing on 5-fluorouracil chemosensitivity involves an Akt/NF-kappa B signaling pathway in colorectal carcinomas ［J］. Int J Cancer, 2010,127(1)： 195-206.

［6］ PONCE DE LEóN V, BARRERA-RODRíGUEZ R. Changes in P-glycoprotein activity are mediated by the growth of a tumour cell line as multicellular spheroids ［J］. Cancer Cell Int, 2005, 5(1)： 20-26.

［7］ 胡章顏, 劉文慶, 劉康達. 黏著斑激酶與腫瘤 ［J］. 基礎醫(yī)學與臨床, 2007, 27(10)： 1177-1180.

［8］ JOSHI B, STRUGNELL S S, GOETZ J G, et al. Phosphorylated caveolin-1 regulates Rho/ROCK-dependent focal adhesion dynamics and tumor cell migration and invasion ［J］. Cancer Res, 2008, 68(20)： 8210-8220.

［9］ BAILEY K M, LIU J. Caveolin-1 up-regulation during epithelial to mesenchymal transition is mediated by focal adhesion kinase ［J］. J Biol Chem, 2008, 283(20)： 13714-13724.