姚高峰,秦秀林,儲(chǔ) 炬,錢(qián)江潮
(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)
S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,簡(jiǎn)稱(chēng)SAM)是一種重要的中間代謝物,廣泛存在于微生物、動(dòng)物、植物體內(nèi),可作為甲基、亞甲基、氨基、核糖、氨丙基的供體,參與體內(nèi)的各種生化反應(yīng)[1~3]。作為一種具有重要生理活性的物質(zhì),SAM在治療肝炎、肝功能紊亂、關(guān)節(jié)炎、抑郁癥、心血管等疾病以及抗衰老、防癌[4]等方面發(fā)揮著重要作用[5,6],市場(chǎng)需求日益增大。
生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)在重組畢赤酵母(Pichiapastoris)中高效表達(dá)SAM合成酶,獲得了能大量積累SAM的重組菌G/DS16[7]。但利用HPLC方法定量分析胞內(nèi)SAM含量及SAM合成酶活性時(shí)存在保留時(shí)間長(zhǎng)或峰寬、分離效果不佳的問(wèn)題[8~10]。
針對(duì)胞內(nèi)SAM抽提液及SAM合成酶測(cè)定體系中SAM的分離,作者對(duì)HPLC方法的流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化,以建立一種分離效果好、精確度高、重復(fù)性好、保留時(shí)間適中的SAM定量分析方法,用于測(cè)定胞內(nèi)SAM含量與SAM合成酶活性。
SAM標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;ATP、L-Met,上海生工生物工程有限公司;高氯酸、甲酸銨、甲酸均為分析純;水為雙蒸水。
Agilent HP1100型高效液相色譜儀,Thermo Scientific型冷凍離心機(jī),QT-1型漩渦混合器,電子天平,恒溫水浴鍋,0.22 μm水相濾頭等。
菌種G/DS16,自行構(gòu)建保藏[7]。G/DS16為基因工程改造菌,甲醇誘導(dǎo)并補(bǔ)加甲硫氨酸后胞內(nèi)SAM合成酶活性增大,SAM含量較高。
Thermo-BioBasic SCX色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲酸銨溶液(pH值4.0),流速1 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量10 μL。
準(zhǔn)確稱(chēng)取31.5 g甲酸銨溶于水中,定容至1000 mL,配制成濃度為0.5 mol·L-1的甲酸銨溶液,用甲酸調(diào)pH值4.0左右。取0.5 mol·L-1甲酸銨溶液適量,稀釋至終濃度為5 mmol·L-1,用甲酸調(diào)pH值4.0左右。流動(dòng)相現(xiàn)配現(xiàn)用,0.22 μm水相濾頭過(guò)濾。
準(zhǔn)確稱(chēng)取SAM標(biāo)準(zhǔn)品25 mg,加水溶解,定容,配制成濃度為1.0 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。取適量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液加水稀釋?zhuān)脻舛确謩e為0.5 g·L-1、0.35 g·L-1、0.25 g·L-1、0.15 g·L-1、0.05 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)樣前用0.22 μm水相濾頭過(guò)濾。
1.6.1 胞內(nèi)SAM抽提樣品
取G/DS16發(fā)酵液1 mL,12 000 r·min-1離心2 min,去上清,加入1 mL10%三氯乙酸(TCA)重懸,于4 ℃靜置抽提2 h,離心后取上清液,用0.22 μm水相濾頭過(guò)濾,待測(cè)。
1.6.2 SAM合成酶活性測(cè)定樣品
發(fā)酵過(guò)程中SAM合成酶的酶活水平是通過(guò)測(cè)定體外酶促反應(yīng)液的SAM含量來(lái)監(jiān)控的。取1 mL G/DS16發(fā)酵液,離心去上清,加1 mL緩沖溶液和等體積的酸洗玻璃珠,按冰水浴30 s、振蕩破碎30 s交替進(jìn)行8次,12 000 r·min-1、4 ℃離心7 min以上,上清即為粗酶液。SAM合成酶活性測(cè)定反應(yīng)體系見(jiàn)表1。
表1 SAM合成酶活性測(cè)定反應(yīng)體系
反應(yīng)體系在37 ℃反應(yīng)1 h,加500 μL 20%高氯酸,4 ℃放置0.5 h以上終止反應(yīng),12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min以上,取上清,用0.22 μm水相濾頭過(guò)濾,待測(cè)。以不加粗酶液、ATP或L-Met的反應(yīng)體系作為對(duì)照。
首先以普遍使用的0.5 mol·L-1(pH值4.0)甲酸銨作為流動(dòng)相進(jìn)行HPLC測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1。
★—SAM —雜質(zhì)(a)SAM標(biāo)準(zhǔn)品 (b)SAM合成酶活性測(cè)定對(duì)照組 (c)SAM合成酶活性測(cè)定樣品 (d)胞內(nèi)SAM抽提樣品
由圖1可知,對(duì)于SAM合成酶活性測(cè)定反應(yīng)體系,0.5 mol·L-1甲酸銨溶液作為流動(dòng)相的分離效果不佳。SAM合成酶活性測(cè)定對(duì)照組分離時(shí)在SAM峰相應(yīng)處出現(xiàn)一個(gè)雜質(zhì)峰(圖1b),這可能是由于其中含有ATP、L-Met以及反應(yīng)生成的一些雜質(zhì),這些物質(zhì)的保留時(shí)間與SAM相同,造成了對(duì)SAM測(cè)定的干擾。而檢測(cè)SAM合成酶活性測(cè)定樣品時(shí),雜質(zhì)峰與SAM峰重疊(圖1c),嚴(yán)重影響了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且,采用0.5 mol·L-1甲酸銨為流動(dòng)相,5 min之內(nèi)可完成洗脫過(guò)程,SAM保留時(shí)間過(guò)短,即使在胞內(nèi)抽提樣品中,也存在保留時(shí)間相近的其它物質(zhì)(圖1d),嚴(yán)重影響了分離效果。
為了獲得較好的分離效果,針對(duì)流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)改變流動(dòng)相中的甲酸銨濃度來(lái)調(diào)節(jié)保留時(shí)間,優(yōu)化的洗脫程序如下:以5 mmol·L-1的甲酸銨洗脫5 min,去除大量雜質(zhì);然后提高甲酸銨的濃度(0.5 mol·L-1甲酸銨∶5 mmol·L-1甲酸銨=9∶1)洗脫4 min;再用0.5 mol·L-1的甲酸銨洗脫3 min,將SAM洗脫;最后用5 mmol·L-1的甲酸銨重新平衡柱子。整個(gè)洗脫過(guò)程中,流動(dòng)相的pH值為4.0,流速為1 mL·min-1。
在優(yōu)化的流動(dòng)相和洗脫程序下進(jìn)行HPLC測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖2。
★—SAM —雜質(zhì)(a)SAM標(biāo)準(zhǔn)品 (b)SAM合成酶活性測(cè)定對(duì)照組 (c)SAM合成酶活性測(cè)定樣品 (d)胞內(nèi)SAM抽提樣品
由圖2可知,SAM標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為10.1 min左右,峰形較好(圖2a);SAM合成酶活性測(cè)定對(duì)照組樣品中的雜質(zhì)與SAM得到了很好的分離(圖2b);SAM合成酶活性測(cè)定樣品以及胞內(nèi)SAM抽提樣品中SAM組分都得到了有效分離,峰寬、峰形較理想,沒(méi)有雜質(zhì)峰的干擾(圖2c、d)。這說(shuō)明適合的SAM保留時(shí)間排除了保留時(shí)間短可能造成的溶劑峰干擾,且相對(duì)于反相C18柱法較長(zhǎng)的保留時(shí)間[11],該方法的檢測(cè)效率明顯提高。
取濃度為0.05~0.5 g·L-1的SAM標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用優(yōu)化的流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行HPLC分析,以峰面積(y)對(duì)SAM濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖3。
圖3 SAM的標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖3可知,在0.05~0.5 g·L-1濃度范圍內(nèi),SAM的濃度和峰面積線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=25.5+7098.0x,R2為0.99996。
取10 μL 250 mg·L-1的SAM標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,平行測(cè)定5次,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)
由表2可知,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%,表明該方法精密度良好。
分別取同一SAM合成酶活性測(cè)定樣品和胞內(nèi)SAM抽提樣品10 μL進(jìn)樣,平行測(cè)定5次,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)
由表3可知,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.49%和0.59%,表明該方法重復(fù)性良好。
分別取已知濃度SAM合成酶活性測(cè)定樣品和胞內(nèi)SAM抽提樣品各6份,3份一組,各添加2個(gè)不同濃度(100 mg·L-1、300 mg·L-1)的SAM標(biāo)準(zhǔn)品,按優(yōu)化色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表4可知,平均回收率為99.3%~100.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%~0.98%,表明該方法回收率高,準(zhǔn)確可靠。
取同一SAM合成酶活性測(cè)定樣品和胞內(nèi)SAM抽提樣品,每隔2 h進(jìn)樣測(cè)定,平行測(cè)定5次,結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)
由表5可知,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.76%和0.69%,表明該方法穩(wěn)定性良好,能夠適用于長(zhǎng)時(shí)間、多樣品的測(cè)定。
在SAM合成酶活性測(cè)定過(guò)程中需要設(shè)置對(duì)照組以扣除本底水平的SAM,一般以不加ATP(對(duì)照組1)或不加L-Met(對(duì)照組2)為對(duì)照組。針對(duì)兩種情況進(jìn)行考察,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 SAM合成酶活性測(cè)定對(duì)照組的考察
由表6可知,實(shí)驗(yàn)組的SAM峰面積為4749.7,而對(duì)照組1為98.2、對(duì)照組2為33.1,兩對(duì)照組SAM峰面積差別較小,僅占實(shí)驗(yàn)組測(cè)定值的1%左右,對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾有限。粗酶液中含有少量的胞內(nèi)水平的ATP和L-Met,ATP作為一種活性物質(zhì),含量較低且穩(wěn)定性較差,而L-Met相比而言較為穩(wěn)定。推測(cè)用于酶活測(cè)定的粗酶液中殘留的L-Met參與了對(duì)照組1的反應(yīng),直接導(dǎo)致了兩對(duì)照組SAM含量的差異,因此,選擇不加ATP的對(duì)照組更能反映實(shí)際的酶活水平。
分析了原有HPLC方法測(cè)定SAM存在的問(wèn)題,針對(duì)流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確性高的SAM定量檢測(cè)方法。確定最佳HPLC條件為:254 nm吸收波長(zhǎng)下,以5 mmol·L-1和0.5 mol·L-1的甲酸銨在不同時(shí)間段以1 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫。在此色譜條件下,胞內(nèi)SAM抽提樣品和SAM合成酶酶促反應(yīng)樣品中的SAM都能夠得到有效分離。該方法簡(jiǎn)單高效、重復(fù)性好、精確度高,并且性能穩(wěn)定,可以較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行大量樣品的準(zhǔn)確測(cè)定,能夠滿(mǎn)足發(fā)酵過(guò)程中菌體胞內(nèi)SAM產(chǎn)量的測(cè)定以及SAM合成酶酶活的監(jiān)控要求。
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