秦嶺巖白菜多糖的提取純化工藝研究

袁菊麗

(寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工系，陜西 寶雞 721013)

秦嶺巖白菜(BergeniascopulosaT.P.Wang)，別名盤龍七，為虎兒草科植物秦嶺巖白菜(Bergenia-scopulosaT.P.Wang)、巖白菜[Bergeniapurpurascns(Hook F.et Thoms.)Engl.]的根莖。主要分布于陜西秦嶺巴山和四川(普格)地區(qū)[1]，生于海拔2500～3600 m的濕潤(rùn)的峭壁石崖縫隙中，全年均可采挖。味澀微苦，性平，入肺、脾、肝、膀胱經(jīng)，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、止血、止咳等功效，廣泛用于急慢性腸胃炎、浮腫、崩漏、白帶、淋癥、痢疾、黃水瘡、禿瘡、疥癬的治療，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性支氣管炎也有一定的療效，還能增強(qiáng)免疫功能。

秦嶺巖白菜的主要活性成分巖白菜素被《中華人民共和國藥典》列為鎮(zhèn)咳祛痰藥，已制成片劑用于慢性支氣管炎的治療[2]。此外秦嶺巖白菜還含有熊果酚苷(Arbutin)、山柰酚、槲皮素、多糖、蒽醌類化合物、多種氨基酸、有機(jī)酸、揮發(fā)油和多種微量元素(Fe、Cr、Cu、Co、Mn等)[3～5]。

近年來，隨著對(duì)多糖生物活性的深入研究，發(fā)現(xiàn)多糖除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)外，還有抗衰老、降血糖、抗凝血等作用，且對(duì)機(jī)體毒副作用小[6]，已成為醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn)。但有關(guān)秦嶺巖白菜多糖的研究報(bào)道甚少。鑒于秦嶺巖白菜中含有豐富的多糖，作者在此對(duì)其多糖的提取純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，擬為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

秦嶺巖白菜，購于陜西眉縣，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院生藥教研室王繼濤副教授鑒定為虎兒草科植物秦嶺巖白菜(BergeniascopulosaT.P.Wang)的干燥根莖。

葡萄糖、蒽酮、硫酸、乙醇，均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

UV-1102型紫外可見分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；薩多利斯GB204型電子天平，瑞典；RE-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SB-3200D型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量測(cè)定方法的建立[7]

采用蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定多糖含量。

(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將葡萄糖于60 ℃烘1 h，再逐漸升溫至105 ℃干燥至恒重。精密稱取該葡萄糖配制成濃度為1.0640 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL分別置于10 mL量瓶中，用蒸餾水定容；分別取2 mL于10 mL的具塞試管中，以2 mL蒸餾水作空白對(duì)照，各加蒽酮濃硫酸試劑4.0 mL，混勻，置沸水浴中加熱8 min，冷卻至室溫，于620 nm處測(cè)定吸光度(A)。以濃度(c)對(duì)A作圖，擬合得線性回歸方程：c=26.011A+0.2224(R=0.9990，n=7)。

1.2.2 秦嶺巖白菜多糖提取工藝的優(yōu)化

影響多糖提取的因素主要有溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度等[8]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)秦嶺巖白菜多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其因素與水平見表1。

表1 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.2.3 秦嶺巖白菜多糖純化工藝的優(yōu)化

采用醇沉法純化秦嶺巖白菜多糖，影響秦嶺巖白菜多糖醇沉的因素主要有乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉?xí)r間、乙醇用量[8]。采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)秦嶺巖白菜多糖醇沉法純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，其因素與水平見表2。

表2 多糖純化正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 提取工藝條件優(yōu)化

取秦嶺巖白菜600 g，用70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇回流提取3次(2 h，2 h，1 h)。藥渣干燥后分別取9份，每份50 g，按提取正交方案(表1)提取，過濾，濃縮，定容，得樣品溶液。分別吸取樣品溶液適量，測(cè)定多糖含量和多糖得率。以二者為衡量指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行綜合評(píng)分：取多糖含量和多糖得率的權(quán)重系數(shù)分別為80和20，對(duì)兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，即x=(多糖含量/最大多糖含量)×80，y=(多糖得率/最大多糖得率)×20，綜合評(píng)分=x+y。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

表3 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可知，影響秦嶺巖白菜多糖提取因素的主次順序?yàn)镃>B>A>D，最佳提取條件為A2B1C3D2，考慮生產(chǎn)實(shí)際，有必要對(duì)各因素水平的顯著性進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表4可知，C因素和D因素水平之間有顯著性差異，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定秦嶺巖白菜多糖的最佳提取工藝為：用20 BV水在90 ℃提取3次，每次0.5 h。

2.2 純化工藝條件優(yōu)化

取秦嶺巖白菜500 g，用70%乙醇回流提取3次(2 h，2 h，1 h)。藥渣干燥后按上述最佳提取工藝提取，過濾，濃縮，用水定容于500 mL量瓶中，準(zhǔn)確吸取相當(dāng)于50 g生藥的上述溶液共9份，按純化正交方案(表2)進(jìn)行乙醇沉淀，減壓過濾，收集沉淀，50 ℃真空干燥，得樣品。

精密稱取經(jīng)干燥的樣品，置于10 mL量瓶中，加適量蒸餾水充分溶解，定容，搖勻，即得各供試品溶液，測(cè)定多糖含量和多糖得率，采用加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行綜合評(píng)分。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表5，方差分析見表6。

表5 多糖純化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表6 多糖純化正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表5、表6可知，影響秦嶺巖白菜多糖純化因素的主次順序?yàn)镃>B>A，秦嶺巖白菜多糖的最佳純化工藝為A2B1C3，即用4 BV 70%乙醇，醇沉24 h。

2.3 討論

(1)本實(shí)驗(yàn)采用蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定多糖含量，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，宜于實(shí)際應(yīng)用。蒽酮試劑的質(zhì)量對(duì)結(jié)果有一定影響，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：提取溫度過高和提取時(shí)間過長(zhǎng)，多糖得率呈下降趨勢(shì)，其原因可能是溫度過高破壞了多糖結(jié)構(gòu)和活性，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致多糖降解，而且雜質(zhì)溶出量增加，影響多糖的溶出。

3 結(jié)論

以多糖含量和多糖得率為綜合指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了秦嶺巖白菜多糖的提取純化工藝。結(jié)果表明，影響熱浸提秦嶺巖白菜多糖的主次因素依次為提取次數(shù)>提取時(shí)間>溶劑用量>提取溫度，最佳提取工藝是：用20 BV水在90 ℃提取3次，每次0.5 h。影響秦嶺巖白菜多糖純化的主次因素依次為乙醇用量>醇沉?xí)r間>乙醇體積分?jǐn)?shù)，最佳純化工藝是：用4 BV 70%乙醇醇沉24 h。實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)綜合考慮產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本，以確定經(jīng)濟(jì)有效的提取純化工藝。

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