牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)*

弓 超,王凌云,周歡敏

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)*

弓 超,王凌云,周歡敏*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

從健康奶牛乳房無(wú)菌采取乳腺組織,通過(guò)添加兩種不同的培養(yǎng)液來(lái)分離、培養(yǎng)、純化牛乳腺上皮細(xì)胞,研究乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)效果。結(jié)果表明,使用組織塊接種可以得到大量細(xì)胞用于體外培養(yǎng)。在以DMEM/F12為基礎(chǔ)的普通培養(yǎng)液中進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng),原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢,細(xì)胞形態(tài)不典型。而添加表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、氫化可的松所組成的完全培養(yǎng)液中,奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)良好。并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,細(xì)胞染色體核型分析,熒光免疫細(xì)胞染色方法鑒定了培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞特異的角蛋白K14,K15。結(jié)果表明,分離培養(yǎng)的細(xì)胞是牛乳腺上皮細(xì)胞。

乳腺上皮細(xì)胞;體外培養(yǎng);奶牛

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器是伴隨動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新生物技術(shù)。利用這項(xiàng)技術(shù)可以從動(dòng)物乳汁中源源不斷地獲取用于醫(yī)療或保健目的的有生物活性的基因表達(dá)產(chǎn)物。使用乳腺上皮細(xì)胞來(lái)檢測(cè)乳腺特異性表達(dá)載體的功能,這一方法具有快捷、方便且能夠真實(shí)反映乳腺表達(dá)載體在生物體內(nèi)表達(dá)水平等優(yōu)點(diǎn)[1]。牛乳腺上皮細(xì)胞系的成功構(gòu)建,為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的研究及檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況打下了基礎(chǔ)。

牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史,但目前已建立的牛乳腺細(xì)胞系并不多。1957年,Boddy M N等[2]首先利用膠原酶消化的方法將乳腺細(xì)胞或乳腺細(xì)胞團(tuán)(含上皮細(xì)胞較多)從乳腺組織中分離出來(lái),第1次實(shí)現(xiàn)了乳腺細(xì)胞的直接培養(yǎng)。由于乳腺上皮細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞,必須不斷地摸索體外培養(yǎng)的最佳條件及添加因子的作用,同時(shí)乳腺細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中容易脫離分化,必須培養(yǎng)在適宜條件下,才可維持其分化狀態(tài)[3]。到目前為止建立的有限的永生化細(xì)胞系難度大,種類少,最早建立的幾個(gè)乳腺上皮細(xì)胞系,有的甚至都發(fā)生了細(xì)胞特性的轉(zhuǎn)移[4]。因此,建立乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法,了解體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征和生物學(xué)特性,對(duì)進(jìn)一步了解泌乳的調(diào)控機(jī)理以及作為一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證乳腺表達(dá)載體的功能都具有重要意義[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 活體材料 牛乳腺組織取自呼和浩特市北亞清真屠宰公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司),二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo),倒置顯微鏡(Nikon),水浴鍋(memmer,德國(guó)),超純水機(jī)(pall,美國(guó)),高壓滅菌鍋(HIRAYAMA),超低溫冰箱(Thermo),液氮罐(樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司),低速臺(tái)式離心機(jī)(Anke),細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12溶液為Hyclone產(chǎn)品;DMSO、胰蛋白酶(T rypsin)、各種無(wú)機(jī)鹽類為Sigma產(chǎn)品,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為 TBD產(chǎn)品,表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素、氫化可的松(Sigma),多聚甲醛、醫(yī)用酒精等為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.4 主要溶液配制 1.乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液:A:DMEM/F12+15%FBS+100單位/mL青霉素+100單位/mL鏈霉素。B:DMEM/F12+15%FBS+10 ng/mL EGF+10 μ g/mL 氫化可的松 +5 μ g/mL胰島素 +100單位/mL青霉素 +100單位/mL鏈霉素。2.細(xì)胞冷凍液:70%DMEM/F12+20%FBS+10%DMSO新鮮配制。34 g/L多聚甲醛固定液:10 mLPBS溶解0.4 g多聚甲醛,磁力攪拌。用NaOH調(diào)pH到7.2,需先加入NaOH邊加熱邊振蕩,加熱溫度控制于60℃以下。

1.2 方法

1.2.1 組織塊法分離培養(yǎng)牛乳腺上皮細(xì)胞 從屠宰場(chǎng)取新鮮的泌乳期的牛乳腺組織,生理鹽水沖洗干凈,直至沒(méi)有乳汁和血液,并置于預(yù)先加有100單位/mL青霉素、100單位/mL鏈霉素的PBS中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。剝離導(dǎo)管組織,去除脂肪及結(jié)締組織,用 PBS反復(fù)沖洗 3遍,剪去導(dǎo)管兩端,并用750 mL/L的酒精處理30 s。在含有微量培養(yǎng)液的青霉素小瓶中,將導(dǎo)管組織盡可能的剪碎;用牙科探針將小組織塊接種到培養(yǎng)皿上,不加培養(yǎng)液,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁4 h左右。然后加適量培養(yǎng)液,放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)及乳腺上皮細(xì)胞的純化 待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底壁,吸去原有培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞兩次,加入 2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA 37℃培養(yǎng)箱消化,不斷在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),待大多數(shù)細(xì)胞回縮,變圓,細(xì)胞間隙擴(kuò)大時(shí),終止消化,反復(fù)吹打細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,利用成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異性,將貼壁時(shí)間較長(zhǎng)的上皮細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),反復(fù)操作3次左右,就會(huì)得到較為純化的乳腺上皮細(xì)胞。

1.2.3 牛乳腺上皮細(xì)胞凍存和復(fù)蘇培養(yǎng) 將消化后的細(xì)胞加入 1 mL新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,用細(xì)胞冷凍液調(diào)整細(xì)胞至5×106個(gè)/mL,每個(gè)凍存管分裝1 mL,放入凍存盒,于-80℃冰箱過(guò)夜,然后投入液氮中長(zhǎng)期保存。當(dāng)細(xì)胞解凍復(fù)蘇時(shí),從液氮罐中取出凍存管,迅速投入37℃的水浴鍋中,快速晃動(dòng),使其完全融化。用5 mL預(yù)熱的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,1 500 r/min,離心5 min棄上清,收集細(xì)胞,加入3 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,將其接種于直徑為 60 mm的培養(yǎng)皿中,于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 培養(yǎng)至第5代的乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí),消化離心,收集細(xì)胞,以6×103個(gè)/mL的密度接種于24孔板中,每孔加入 1 mL培養(yǎng)液,于 37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每天同一時(shí)間用2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA消化3孔細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),然后取平均值。連續(xù)進(jìn)行8 d。計(jì)數(shù)期間每隔3 d換一次培養(yǎng)液。以培養(yǎng)的時(shí)間為橫坐標(biāo),每天所計(jì)3孔細(xì)胞的平均值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 乳腺上皮細(xì)胞染色體分析

(1)待上皮細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí),加入秋水仙素(終濃度為0.2 μ g/mL),37 ℃培養(yǎng)4 h;

(2)棄掉培養(yǎng)液,胰蛋白酶消化10 min,終止消化,1 500 r/min,離心5 min棄上清,收集細(xì)胞;

(3)緩慢加入37℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl,37℃低滲處理30 min;

(4)低滲后加入10 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1),預(yù)固定5 min;

(5)1 500 r/min,離心 5 min,棄上清,留約500 μ L,輕振懸浮細(xì)胞 ;

(6)加10 mL固定液,第1 mL逐滴加,混勻,室溫固定20 min;

(7)重復(fù)步驟5;(8)重復(fù)步驟6;(9)1 200 r/min,離心5 min,棄上清 ,加 1.5 mL固定液,輕振懸浮細(xì)胞;

(10)吸取少量細(xì)胞懸液,滴落在預(yù)冷的干凈的載玻片上,迅速在酒精燈火焰上烘烤;

(11)制備好的染色體滴片用Giemsa染色液浸染15 min,流水沖洗干凈。自然干燥后,在顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。

1.2.6 熒光免疫細(xì)胞染色法鑒定乳腺上皮細(xì)胞用熒光免疫染色法檢測(cè)培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中特有蛋白的表達(dá)情況,同時(shí)用牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照組:

(1)將生長(zhǎng)正常的乳腺上皮細(xì)胞,在室溫下,用40 mL/L多聚甲醛固定生長(zhǎng)于 24孔板中的細(xì)胞30 min,之后PBS清洗3次,每次5 min;

(2)加入 0.3%的 Triton X-100通透處理5 min,PBS清洗3次,每次5 min;(3)加入100 mL/L正常山羊血清的PBS封閉液處理30 min;

(4)加小鼠抗人的細(xì)胞角蛋白K14和K15單克隆抗體(1∶100稀釋)于室溫下振蕩孵育1 h;

(5)加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的二抗(1∶50稀釋),室溫下避光振蕩孵育30 min,PBS清洗3次,每次5 min;

(6)加入含碘化丙錠(propidium iodide,PI)10 μ g/mL 的PB,室溫下染核10 min,用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩種培養(yǎng)液對(duì)乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的影響

用普通DMEM/F12培養(yǎng)液和添加因子的完全培養(yǎng)液均能夠獲得乳腺上皮細(xì)胞。但是兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的原代細(xì)胞析出時(shí)間及細(xì)胞形態(tài)不同。普通DMEM/F12培養(yǎng)液經(jīng)原代培養(yǎng)10 d左右才會(huì)有細(xì)胞析出(圖1),而添加因子的完全培養(yǎng)液一般在7 d左右就會(huì)有細(xì)胞析出(圖2)。兩種方法長(zhǎng)出的都是乳腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的混合體,成纖維細(xì)胞多成條狀、旋渦狀或放射狀排列,而上皮細(xì)胞則多呈短的梭形或多角形,細(xì)胞之間緊密相靠,相互銜接,連接成片(圖3)。但是添加因子的完全培養(yǎng)液得到的乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)更為典型(圖2)。

圖1 普通DMEM/F12培養(yǎng)液原代培養(yǎng)10 d(100×)Fig.1 The bovine mammary epithelial cells cultured with DMEM/F12 for 10 d(100×)

圖2 添加因子的完全培養(yǎng)液原代培養(yǎng)10 d(100×) Fig.2 The bovine mammary epithelial cells cultured with complete g rowth medium for 10 d(100×)

圖3 原代培養(yǎng)中上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混雜生長(zhǎng)的狀態(tài)(100×)Fig.3 T he bovine mammary epithelial cells primarily cultured(100×)

2.2 乳腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化培養(yǎng)

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,在消化培養(yǎng)時(shí),常是成纖維細(xì)胞先脫壁,而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間才脫壁;而且成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比,其貼壁過(guò)程快,大部分細(xì)胞常能在短時(shí)間內(nèi)(大約10 min～30 min)完成附著過(guò)程(但不一定完全伸展),而上皮細(xì)胞大部分在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定,稍加震蕩即浮起。綜合這兩個(gè)特性進(jìn)行純化,在1 h貼壁培養(yǎng)的孔中,長(zhǎng)的基本都是成纖維細(xì)胞,隨后的孔中成纖維細(xì)胞逐漸變少。用這種方法一般經(jīng)過(guò)2次～3次的選擇傳代即可得到純化的乳腺上皮細(xì)胞系(圖4)。

2.3 乳腺上皮細(xì)胞的解凍復(fù)蘇培養(yǎng)

凍存的牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)解凍接種培養(yǎng)皿后,保持著細(xì)胞聚集生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞的典型特征。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞形態(tài)良好。由此證明常規(guī)的細(xì)胞冷凍保存及解凍復(fù)蘇的培養(yǎng)方法適用于牛乳腺上皮細(xì)胞(圖5)。

2.4 乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo),平均細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制了牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖(圖6)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本呈現(xiàn)典型的“S”形,符合細(xì)胞生長(zhǎng)的一般生物學(xué)規(guī)律。生長(zhǎng)曲線顯示:牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期為0 d～2 d,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2 d～6 d,6 d后進(jìn)入平臺(tái)期。試驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞具有正常細(xì)胞的分裂增殖特征。

2.5 乳腺上皮細(xì)胞染色體分析

觀察結(jié)果:細(xì)胞核型穩(wěn)定,在離體培養(yǎng)條件下不發(fā)生轉(zhuǎn)化。選擇分散良好和輪廓清晰的30個(gè)分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明28個(gè)分裂相具有正常的染色體數(shù)目(2n=60),正常率93.3%(28/30)。圖7為其中的1個(gè)分裂相。

2.6 熒光免疫細(xì)胞染色分析細(xì)胞角蛋白K14、K15的表達(dá)

應(yīng)用熒光免疫細(xì)胞染色分析了分離培養(yǎng)并經(jīng)過(guò)純化后的乳腺上皮細(xì)胞的骨架蛋白——角蛋白14、15表達(dá)情況,分析結(jié)果表明:分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞幾乎全部呈陽(yáng)性(圖8～圖11)。這一結(jié)果證明了分離培養(yǎng)的細(xì)胞是乳腺上皮來(lái)源且具有乳腺上皮細(xì)胞的正常生理功能,牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照,成纖維細(xì)胞胞質(zhì)無(wú)顯色。

圖4 乳腺上皮細(xì)胞純化(100×)Fig.4 The bovine mammary epithelial cells purified(100×)

圖5 解凍后的乳腺上皮細(xì)胞(100×)Fig.5 The bovine mammary epithelial cells cultured after thawing(100×)

圖6 牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 Fig.6 The growth curve of the bovine mammary epithelial cells

圖7 牛乳腺上皮細(xì)胞的染色體(2n=60)Fig.7 Chromosome of the bovine mammary epithelial cells(2n=60)

圖8 純化的乳腺上皮細(xì)胞K15抗體染色(20×)Fig.8.The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K15(20×)

圖9 暗場(chǎng)條件下純化的乳腺上皮細(xì)胞K15抗體染色(20×)Fig.9 The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K15 in dark field(20×)

圖 10 純化的乳腺上皮細(xì)胞K14抗體染色(20×)Fig.10 The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K14(20×)

圖11 暗場(chǎng)條件下純化的乳腺上皮細(xì)胞K14抗體染色(20×)Fig.11 The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K14 in dark field(20×)

圖12 牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照(20×)Fig.12 Negative control,the bovine fibroblasts stained with the antibodies×20

3 討論

3.1 牛乳腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)

乳腺是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的一個(gè)主要研究對(duì)象,因?yàn)橥ㄟ^(guò)遺傳操作可改變?nèi)橹煞?獲得具有生物活性成分的重要外源產(chǎn)物[6]。但通過(guò)乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)能達(dá)到商品化生產(chǎn)所需的為數(shù)不多。鑒于此,本研究建立了正常牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步研究BMEC的增殖和分化以及基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供了合適的細(xì)胞平臺(tái)。

動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)主要有兩種方法,即一是組織塊培養(yǎng)法,從貼壁的組織塊周圍可長(zhǎng)出細(xì)胞單層,這種方法已被證明適用于牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)[7];二是用酶消化法收集單細(xì)胞懸液,以密度梯度離心法純化細(xì)胞。一些研究表明用酶消化法進(jìn)行牛乳腺細(xì)胞原代培養(yǎng)[8]時(shí),容易損害細(xì)胞,特別是對(duì)上皮細(xì)胞損傷更大。

乳腺是由乳腺組織、結(jié)締組織和脂肪組織組成的,而乳腺組織是由導(dǎo)管和腺泡組成的。取材過(guò)程中一定要注意避免誤取結(jié)締組織和脂肪組織等非乳腺組織,從而可以避免培養(yǎng)過(guò)程中雜細(xì)胞的污染。本研究用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行牛乳腺上皮的原代培養(yǎng),選取導(dǎo)管作為組織塊的來(lái)源,可以盡量避免組織污染[9]。雖然上皮細(xì)胞從組織塊中遷出的速度較慢,所需時(shí)間較長(zhǎng),但生長(zhǎng)的細(xì)胞比較整齊,不易丟失損傷細(xì)胞,而且操作方法簡(jiǎn)單。原代培養(yǎng)1周左右,組織塊周圍游離出幾個(gè)至十幾個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)在一塊,細(xì)胞為鵝卵石狀,呈典型的上皮細(xì)胞特征。未純化的原代培養(yǎng)物為乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合物。

對(duì)于細(xì)胞系的純化,本試驗(yàn)綜合了兩種細(xì)胞純化方法:一種為酶消化法,即根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,在消化培養(yǎng)時(shí),常是成纖維細(xì)胞先脫壁,而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間才脫壁,特別是在原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期這種差別尤為明顯,因此利用這種差異采用多次消化法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi);另一種方法是反復(fù)貼壁法,因?yàn)槌衫w維細(xì)胞能在很短時(shí)間內(nèi)貼壁,而上皮細(xì)胞貼壁的時(shí)間則較長(zhǎng)。綜合這兩種純化方法能夠更快速、更準(zhǔn)確的獲得純化的牛乳腺上皮細(xì)胞系。

圖 13牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照(20×)Fig.13 Negative control,the bovine fibroblasts stained with the antibodies in dark field×20

對(duì)于乳腺上皮細(xì)胞系的凍存,采用與其他類型的細(xì)胞相同的細(xì)胞凍存液也得到了較好的效果,細(xì)胞復(fù)蘇后活力較好。而Han Hu等[10]所使用的細(xì)胞凍存液是90%FBS加10%DMSO,對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)特性也沒(méi)有改變,這可能與血清對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)特性的維持有關(guān)。

3.2 不同培養(yǎng)液對(duì)乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的影響

乳腺上皮細(xì)胞是高度分化的體細(xì)胞,體外培養(yǎng)時(shí),有一定的困難,同時(shí)乳腺里含有各種類型的細(xì)胞,并且乳腺細(xì)胞本身很脆弱,在體外培養(yǎng)經(jīng)12代左右就明顯衰老[11]。如何得到純度高、活力旺盛的乳腺上皮細(xì)胞,合適的培養(yǎng)條件對(duì)建立細(xì)胞系是十分重要的。特別是培養(yǎng)液和添加因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力影響更大[12]。本試驗(yàn)采用兩種培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),一種為普通培養(yǎng)液(A:DMEM/F12+15%FBS+100單位/mL青霉素+100單位/mL鏈霉素),另一種為添加因子培養(yǎng)液(B:DMEM/F12+15%FBS+10 ng/mL EGF+10 μ g/mL 氫化可的松+5 μ g/mL胰島素+100單位/mL青霉素+100單位/mL鏈霉素)。在原代培養(yǎng)過(guò)程中,A培養(yǎng)液可以培養(yǎng)出乳腺細(xì)胞,但培養(yǎng)出細(xì)胞的時(shí)間要大于B培養(yǎng)液培養(yǎng)出細(xì)胞的時(shí)間。一般用A培養(yǎng)液大概10 d～15 d左右才會(huì)有細(xì)胞混合生長(zhǎng)出現(xiàn)。而選用B培養(yǎng)液,組織塊法大概7 d左右就會(huì)有細(xì)胞長(zhǎng)出。上述結(jié)果表明,A培養(yǎng)液與B培養(yǎng)液比較而言,A培養(yǎng)液不適于乳腺上皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)。EGF、胰島素、氫化可的松3種因子協(xié)同作用下可以顯著的促進(jìn)BMEC的增殖。

當(dāng)培養(yǎng)液中添加胰島素、EGF、氫化可的松時(shí),細(xì)胞增殖效果好。胰島素在體外培養(yǎng)中被證實(shí)不僅有促進(jìn)泌乳的作用還有促進(jìn)DNA合成的作用[13]。Hansen H等[14]證明羊的乳腺上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下也需要胰島素、氫化可的松、催乳素的作用才能分泌β-乳球蛋白和β-酪蛋白,但是綿羊乳腺上皮細(xì)胞對(duì)氫化可的松的反應(yīng)不明顯,山羊乳腺上皮細(xì)胞乳脂的合成對(duì)氫化可的松的反應(yīng)也不明顯。研究表明[15],EGF雖然其名為表皮生長(zhǎng)因子,但它不僅對(duì)多種組織來(lái)源的上皮細(xì)胞都有促增殖活性,而且還對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用,同時(shí)還可以作為腫瘤的促進(jìn)因子。胰島素是細(xì)胞周期的主要外源性調(diào)節(jié)因子,和EGF協(xié)同作用可推進(jìn)細(xì)胞周期向前行進(jìn),促使細(xì)胞由G1后期進(jìn)入S分裂期。胰島素不僅對(duì)于乳蛋白基因的表達(dá)是必需的,而且在牛的乳腺組織中在多個(gè)時(shí)期都會(huì)促進(jìn)和調(diào)控乳蛋白的合成[16]。

3.3 乳腺上皮細(xì)胞的體外鑒定

體外培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞鑒定一般是鑒別細(xì)胞的標(biāo)志物,如細(xì)胞骨架角蛋白,它是乳腺上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志蛋白[17]。本研究中所使用的小鼠抗人的細(xì)胞角蛋白K14和K15單克隆抗體對(duì)乳腺上皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng),應(yīng)用此抗體對(duì)分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞的免疫組化染色幾乎全部呈強(qiáng)陽(yáng)性,這一結(jié)果證明了分離培養(yǎng)的細(xì)胞是乳腺上皮細(xì)胞且乳腺上皮細(xì)胞的純度很高。

[1]徐曼妮,厲曙光,趙建陽(yáng),等.乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)載體的檢測(cè)方法[J].生物技術(shù)通報(bào),2003(5):23-26.

[2]Boddy M N,Furnari B,Mondesert O,et al.Replication checkpoint enforced by kinases Cds1 and Chk1[J].Science,1998,280(5365):909-912.

[3]Thordarson G,Ogren L,Day J R,et al.Mammary gland development and alpha-lactalbumin production in hypophysectomized pregnant mice[J].Biol Reprod,1989,40(3):517-524.

[4]Lahiry L,Saha B,Chakraborty J,et al.Contribution of p53 mediated Bax transactivation in the aflavin-induced mammary epithelial carcinoma cell apoptosis[J].Apoptosis,2008,13(6):771-781.

[5]鄭月茂,彭新榮,徐永平,等.體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,32(3):37-41.

[6]多曙光,吳應(yīng)積,羅奮華,等.牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性[J].動(dòng)物學(xué)研究,2006,27(3):299-305

[7]杜 娟,鈥和雙,王根林.奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及高溫對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2007,23(3):471-476.

[8]Institute of Animal Science.Characterization of an epithelial cell line from bovine mammary gland[J].In Vitro Cell Biol Anim,2002,38:282-292

[9]白 俊.LacS原核表達(dá)載體的構(gòu)建-蛋白表達(dá)純化和乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)[D].內(nèi)蒙古呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2010.

[10]Han Hu,Jiaqi Wang,Juan J Loor,et al.In vitroculture and oharacterization of a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow[J].PLoS ONE,2009,4(11):e7636.

[11]閆 晶,賀小英,潘春留,等.pEGFP-hTERT真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染牛乳腺細(xì)胞方法的優(yōu)化[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(5):14-19

[12]Dale E.Synthesis of ex tracellular matrix proteins in bovine mammary epithelial cells[J].In Vitro Cell BiolAnim.,2001,37:629-632

[13]Hans Otto Hansen,Jens Knudsen.Bovine mammary teat and ductal epithelial cell cultures[J].Am J Vet Res,1994,55:239-246.

[14]Hansen H O,Knudsan.Lactating goat mammary gland cells in culture[J].Camp Biochcm Physioi,1991,99A:129-135

[15]王治國(guó),王加啟.奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及應(yīng)用[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007.

[16]Menzies K K,Lefevre C,Macmillan K L,et al.Insulin regulates milk protein synthesis at multiple levels in the bovine mammary gland[J].Funct Integr Genomics,2009,9(2):197-217.

[17]于 婷,陳志偉,劉東武.牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器,2009,7(3):18-24

Study on Culture of Bovine Mammary Epithelial Cellsin Vitro

GONG Chao,WANG Ling-yun,ZHOU Huan-min

(College Of Lif e Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia,010018,China)

In this research,bovine mammary epithelial cells(BMEC)were isolated,purified and culturedin vitro,and further characterized by morphological observation and karyotyping analysis.The tissue-specific expression of cytokeratin K14 and K15 in BMEC was also identified by immunofluorescent cytochemical staining.The results showed that the large number of BMEC could be separated from mammary tissue inoculation.Complete growth medium can cultured BMEC better than DMEM/F12.All these results demonstrated that the purified cells were BMEC.

BMEC;in vitroculture;dairy cow

Q813.11

A

1007-5038(2011)07-0066-06

2010-12-01

內(nèi)蒙古生物高科技資助項(xiàng)目

弓 超(1984-),男,內(nèi)蒙古呼和浩特人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物發(fā)育與胚胎工程學(xué)研究。*通訊作者