HPLC同時測定復方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶的含量*

馮學忠,黎華鵬,盤苑芷,方炳虎,張魁華

(1.廣東大華農動物保健品股份有限公司,廣東新興 527400;2.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東廣州 510642)

復方二甲硝咪唑可溶性粉又稱復方地美硝唑可溶性粉,其主要成分為地美硝唑[1]、甲氧芐啶[2]、磺胺對甲氧嘧啶[3]。本品為廣譜抗菌和抗球蟲藥,對革蘭陰性菌(雞巴氏桿菌、大腸埃希菌、沙門菌等)、革蘭陽性菌(化膿性鏈球菌、肺炎球菌等)、雞球蟲、組織滴蟲和豬痢短螺旋體等均有良好作用[4-6]。主要用于防治雞的巴氏桿菌病、大腸埃希菌病、球蟲病、傷寒及家禽的肺炎、腸炎等。復方二甲硝咪唑可溶性粉在《進口獸藥質量標準》1999年版中是采用高效液相色譜法測定含量[7-8],其是采用甲醇-水不同比例的流動相,不同的檢測波長分別測定甲氧芐啶、地美硝唑與磺胺對甲氧嘧啶。本試驗通過優(yōu)化色譜條件,建立了同時測定上述3種成分含量的高效液相色譜法,其具有簡便可行、準確、快速的特點,減少了配制流動相、稀釋樣品、進樣次數(shù)等實驗步驟,提高了工作效率,取得了滿意效果,可為完善該制劑的質量標準提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;CP225D型電子天平,德國賽多利斯有限公司;pHS-3C型精密pH計,上海精密科學儀器有限公司。

1.1.2 藥品 地美硝唑對照品,批號為H 0390906,含量99.9%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;甲氧芐啶對照品,批號為 H 0160704,含量100.0%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;磺胺對甲氧嘧啶對照品,批號為H 0300904,含量100.0%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;復方二甲硝咪唑可溶性粉,規(guī)格為100g:地美硝唑8.0g+磺胺對甲氧嘧啶7.4g+甲氧芐啶2.0g,批號為20100501,20100502,20100503,廣東大華農動物保健品股份有限公司;磷酸為分析純;乙腈、甲醇為色譜純;水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶波長的確定 精密稱取地美硝唑對照品、甲氧芐啶對照品、磺胺對甲氧嘧啶對照品適量,用500mL/L甲醇溶液分別制成每1 mL中含10、5、10μg的標準溶液。以500mL/L甲醇溶液為空白,按照紫外分光光度法,在190 nm～500 nm波長范圍內進行紫外吸收圖譜掃描,并確定檢測波長。

1.2.2 1 g/L磷酸溶液 取磷酸1.18mL,加水適量使成1 000 mL,搖勻,備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Discovery C18,尺寸:250 mm×4.60mm,5μm;流動相:1 g/L磷酸溶液-乙腈(90:18);檢測波長:230 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:20μL。

1.2.4 標準儲備液的制備

1.2.4.1 地美硝唑標準儲備液 精密稱定地美硝唑對照品27m g,置50mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀釋至刻度,制成0.54 mg/mL溶液,搖勻,作為標準儲備液。

1.2.4.2 甲氧芐啶標準儲備液 精密稱定甲氧芐啶對照品27 mg,置200mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀釋至刻度,制成0.135 mg/mL溶液,搖勻,作為標準儲備液。

1.2.4.3 磺胺對甲氧嘧啶標準儲備液 精密稱定磺胺對甲氧嘧啶對照品25 mg,置50 mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀釋至刻度,制成0.5mg/mL溶液,搖勻,作為標準儲備液。

1.2.5 標準曲線的繪制

1.2.5.1 地美硝唑標準曲線 精密吸取上述1.2.4.1標準儲備液 1、2、3、4、5 mL,分別置于25 mL的容量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻;制成濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL 的標準溶液,照高效液相色譜法測定。

1.2.5.2 甲氧芐啶標準曲線 精密吸取上述1.2.4.2標準儲備液 1 、2 、3、4、5、6 mL,分別置于100 mL的容量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻 ;制成濃度分別為 5、10 、15、20、25 、30 μg/mL的標準溶液,照高效液相色譜法測定。

1.2.5.3 磺胺對甲氧嘧啶標準曲線 精密吸取上述 1.2.4.3 標準儲備液 1、2、3、4 、5mL,分別置于25 mL的容量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻;制成濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL 的標準溶液,照高效液相色譜法測定。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱定復方二甲硝咪唑可溶性粉(批號:20100501)約 338 mg,置50 mL容量瓶中,加500mL/L甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置50 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度 ,搖勻,放置 0、0.5 、1.0、1.5、2.0、2.5 h,照高效液相色譜法進行測定。

1.2.7 系統(tǒng)適應性 精密稱定復方二甲硝咪唑可溶性粉(批號:20100501)約 338m g,按 1.2.6方法進行稀釋并檢測。

1.2.8 空白試驗 按處方比例稱取輔料適量,制備不含地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶的空白樣品,按1.2.6項下方法進行稀釋并進行測定。

1.2.9 回收試驗 精密稱定地美硝唑對照品、甲氧芐啶對照品、磺胺對甲氧嘧啶對照品適量,按處方量加入其他輔料,制成其含量為標示量的80%、100%、120%三種樣品,分別按1.2.6項下方法稀釋并測定其峰面積。

1.2.10 精密度試驗 精密稱定復方二甲硝咪唑可溶性粉(批號:20100501)約338 mg,按1.2.6項下方法進行溶解稀釋,搖勻,作為測定復方二甲硝咪唑可溶性粉精密度試驗用溶液,重復測定5次,進行精密度試驗,照高效液相色譜方法進行測定,按外標法以峰面積計算。

1.2.11 樣品含量測定 取批號 20100501,20100502,20100503的復方二甲硝咪唑可溶性粉,分別精密稱定約338 mg,按1.2.6項下方法溶解稀釋,搖勻,作為供試品溶液;另外精密吸取1.2.4項下的標準儲備液各5 mL置同一個50 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液,按1.2.3項下的色譜條件測定,用外標法計算樣品中地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶的含量。

2 結果

2.1 檢測波長結果

在190 nm～500 nm波長范圍內進行紫外吸收圖譜掃描顯示,在波長230 nm處分別都有最大吸收或較大吸收分別見(圖1～圖3)。因此,選擇230 nm為檢測波長。

2.2 標準曲線

2.2.1 地美硝唑標準曲線 結果見表1。以峰面積(A)為縱坐標,濃度(C)為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程:A=25.58C+4.31(r=1,n=5,C的單位為 μg/mL)。結果表明,在 20μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內,濃度與峰面積呈良好的線性關系(圖4)。

表1 地美硝唑標準溶液的峰面積Table1 The peak-area of standard solution of dimetridazole

圖1 地美硝唑紫外吸收圖譜Fig.1 The UV spectrum of dimetridazole

圖2 甲氧芐啶紫外吸收圖譜 Fig.2 The UV spectrum of trimethoprim

圖3 磺胺對甲氧嘧啶紫外吸收圖譜Fig.3 The UV spectrum of sulfamethoxydiazine

圖4 地美硝唑標準曲線Fig.4 The standard cu rve of dimetridazole

2.2.2 甲氧芐啶標準曲線 結果見表2。以峰面積(A)為縱坐標,濃度(C)為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程:A=99.37C-6.53(r=0.999 9,n=6,C的單位為μg/mL)。結果表明,在5μg/mL～30 μg/mL的濃度范圍內,濃度與峰面積呈良好的線性關系(圖5)。

表2 甲氧芐啶標準溶液的峰面積Table2 The peak-area of standard solution of trimethoprim

2.2.3 磺胺對甲氧嘧啶標準曲線 結果見表3。以峰面積(A)為縱坐標,濃度(C)為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程:A=64.35C+6.35(r=1,n=5,C的單位為μg/mL)。結果表明,在20μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內,濃度與峰面積呈良好的線性關系(圖6)。

表3 磺胺對甲氧嘧啶標準溶液的峰面積Table3 The peak-area of standard solu tion of su lfamethoxydiazine

圖5 甲氧芐啶標準曲線Fig.5 The standard cu rve of trimethoprim

圖6 磺胺對甲氧嘧啶標準曲線Fig.6 The standard curve of su lfamethoxydiazine

2.3 穩(wěn)定性試驗結果

從表4可見,復方二甲硝咪唑可溶性粉在2.5 h內峰面積基本保持不變,穩(wěn)定性良好。

表4 復方二甲硝咪唑可溶性粉的穩(wěn)定性試驗結果Table4 The stability result of compound dimetrdazolie solub le pow der

圖7 高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatogram

2.4 系統(tǒng)適應性結果

連續(xù)進樣6次,所得峰面積的RSD分別為地硝咪唑0.26%,甲氧芐啶 0.16%,磺胺對甲氧嘧啶0.02%。理論板數(shù)分別為按地美硝唑峰計算,理論板數(shù)為 17417;按甲氧芐啶峰計算,理論板數(shù)為15881;按磺胺對甲氧嘧啶峰計算,理論板數(shù)為20083。保留時間分別約為地美硝唑5.0 min,甲氧芐啶8.2 min,磺胺對甲氧嘧啶11.9min。地美硝唑峰、甲氧芐啶峰和磺胺對甲氧嘧啶峰的分離度符合要求(圖7)。

2.5 空白試驗結果

結果在其3種成分的保留時間處均無吸收,不干擾測定,符合要求。

2.6 回收試驗結果

結果見表5,根據(jù)其標準曲線,分別求出地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶的回收率,平均回收率分別為99.87%、99.83%和99.57%,RSD分別為0.73%、1.46%和0.85%。

結果表明,復方二甲硝咪唑可溶性粉回收率試驗符合要求。

2.7 精密度試驗結果

復方二甲硝咪唑可溶性粉中3種成分含量的RSD分別為(地美硝唑)0.22%、(甲氧芐啶)0.15%、(磺胺對甲氧芐啶)0.03%,結果見表6。結果表明,本法具有良好的精密度。

2.8 樣品含量測定結果

結果見表7。結果表明,復方二甲硝咪唑可溶性粉的含量符合要求。

3 討論

3.1 流動相的選擇

《進口獸藥質量標準》1999年版中是選用液相色譜中最基礎溶劑組合甲醇-水作為流動相,結果色譜峰拖尾嚴重,分離度及柱效較低。曾試用乙腈-水組合作為流動相結果也是一樣。鑒于地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶等成分具有弱堿性,考慮在流動相中使用偏酸性的緩沖液,這樣可以改善峰形,防止拖尾,分離效果較好。通過對緩沖液種類,濃度,有機溶劑,流動相配比等影響分離效果的參數(shù)進行多次選擇優(yōu)化,最終確定用0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)作為流動相。

表5 回收率試驗結果Table5 Recovery test results

表6 精密度試驗結果Table6 Precision of compound dimetrdazolie soluble powder

表7 樣品含量結果Table7 conten t of the sample results

3.2 檢測波長的選擇

本試驗對地美硝唑、甲氧芐啶和磺胺對甲氧嘧啶3種對照品溶液進行了190 nm～500 nm紫外光譜掃描,結果表明,地美硝唑在316 nm、228 nm 和197 nm出有最大吸收,在230 nm處有較強吸收;甲氧芐啶在280 nm和204 nm處有最大吸收,在230 nm處也有較強吸收;磺胺對甲氧嘧啶在270、230、212、197 nm處有最大吸收?？紤]到在200 nm附近存在“邊緣效應”,溶劑在此波長下也有紫外吸收,會對檢測帶來較大影響;而且甲氧芐啶在樣品中含量較低,地美硝唑和磺胺對甲氧嘧啶在樣品中含量較高,為了提高甲氧芐啶檢測靈敏度,減少3個成分峰之間峰高的差別,所以選擇了230 nm作為檢測波長。

3.3 試驗可行性

在所選定色譜條件下,對樣品中的地美硝唑、甲氧芐啶和磺胺對甲氧嘧啶等成分進行測定,發(fā)現(xiàn)各峰之間均無干擾,各峰的分離度均大于1.5,而且峰形較好,對樣品進行回收率試驗亦證明了此法同時測定復方二甲硝咪唑可溶性粉中三種主要成分是一種簡便、有效、準確的方法。在實際應用過程中,針對某一種樣品,可通過調節(jié)流動相配比來控制分析時間,提高分析效率。此外,操作過程簡單,減少樣品在處理過程中的損失,定量更準確,易于推廣。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二000年一部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2000:64-65.

[2]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二00五年一部[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006:50-51.

[3]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二00五年一部[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006:337-338.

[4]朱模忠.獸藥手冊[M].北京:化學工業(yè)出版社,2002:219.

[5]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典·獸藥使用指南·化學藥品卷二 00五年版[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006:76-77.

[6]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典·獸藥使用指南·化學藥品卷二 00五年版[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006:70.

[7]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二00五年一部[M].北京:中國農業(yè)出版社,2006:附錄32-35.

[8]中華人民共和國農業(yè)部.進口獸藥質量標準[S].1999:74-75.

[9]汪紀倉,高小龍,楊 軍,等.高效液相色譜法檢測雞肌肉組織中地美硝唑及其羥基代謝物[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2006(12):76-77.

[10]張志美,張春華,沈志強.HPLC法同時檢測復方磺胺間甲氧嘧啶鈉溶液中磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶[J].中國獸藥雜志,2008,42(11):27-29.

[11]宋慧敏,畢昊容,邵德佳,等.獸藥粉劑/預混劑中甲氧芐啶的測定[J].中國獸藥雜志,2007,41(1):33-35.

[12]王 英.高效液相色譜法同時測定聯(lián)磺甲氧芐啶片三組分的含量[J].海峽藥學,2007,19(3):47-48.

[13]韓志云,朱迎.HPLC法測定頭孢氨芐甲氧芐啶膠囊含量的方法改進[J].海峽藥學,2007,19(1):48-49.

[14]高 嶸,張 琦.高效液相色譜法測定豬肌肉組織中磺胺類藥物的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2007,17(10):1805-1807.

[15]潘鵬飛,陳立柱,孫 菲.HPLC法測定聯(lián)磺甲氧芐啶片中甲氧芐啶的含量[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2007,28(7):816-817.