王俊杰,舒 洋,曹 欣,蔣顯勇,吳海燕,陳福春,方會龍,陳東林
藤茶 (ampelopsis grossedentata)是葡萄科植物蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物的嫩莖葉,多生長在海拔200~800 m高的山地上,主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等地。長久以來,我國壯族和瑤族人將其嫩莖葉制成保健茶,用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、瘡癤等癥。其化學(xué)成分主要為黃酮類、低聚芪類、酚類[1],其中黃酮類中的二氫楊梅素含量豐富,在幼葉莖中含量占干重的20%以上,在幼葉中可達(dá)40%[2]。我們報道了藤茶及其主要成分二氫楊梅素具有護(hù)肝和抗肝纖維化的作用[3-7],本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究藤茶提取物對小鼠非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的保護(hù)作用,為其保健功效的評價提供依據(jù)。
1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠48只〔合格證號:Scxk(湘)2009-0012〕,雄性,體質(zhì)量18~22 g,購自長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部。實驗前適應(yīng)環(huán)境3 d,自由飲水。
1.2 儀器和試劑 儀器:Au640型全自動生化分析儀 (日本Olympous公司),TSJ-O脫水機(jī) (常州市中威電子儀器廠),BMJ-Ⅲ型包埋機(jī) (常州市中威電子儀器廠),Olympus顯微鏡 (日本Olympous公司)。試劑:膽固醇、丙硫氧嘧啶、膽酸鈉,均購于上海藍(lán)季生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 藤茶提取物的制備 采摘郴州王仙嶺后山藤茶,晾干,粉碎,95℃熱水提取10 min(料液比1∶20),過濾。濾渣微波加熱3 min后合并濾液,加熱提取,過濾,濾液室溫下冷卻,析出晶體,干燥得藤茶提取物。吸光度法測定純度:標(biāo)準(zhǔn)品計算藥物濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測藥品溶液加入5%AlCl3溶液3 ml,用95%乙醇定容至10 ml,搖勻后室溫靜置40 min,在404 nm波長下測定吸光度值,標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥物濃度。
1.3.2 造模方法 小鼠高脂飼料喂養(yǎng),自由飲水。高脂飼料配方:添加2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉到基礎(chǔ)飼料中,混合均勻,壓制成條。
1.3.3 分組 48只小鼠隨機(jī)分為4組,每組12只,分別為正常對照組、模型組、陽性對照組及藤茶治療組。正常對照組:正常方法飼養(yǎng)60 d,普通條形飼料喂養(yǎng);模型組:高脂飲食60 d制備NAFLD模型;陽性對照組:在模型組高脂飲食的基礎(chǔ)上灌胃易善復(fù) (多烯磷脂酰膽堿膠囊)150 mg/kg,從實驗第14天開始,1次/d,共治療42 d;藤茶治療組:在模型組高脂飲食基礎(chǔ)上灌胃藤茶提取物300 mg/kg,從實驗第14天開始,1次/d,共治療42 d。
1.3.4 實驗方法 (1)實驗第60天處死4組小鼠。動物處死前禁食12 h,稱體質(zhì)量,眼眶內(nèi)眥取血后分離血清,用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、總膽固醇 (TC)、三酰甘油 (TG)。(2)迅速剪開腹腔,觀察肝臟形態(tài)。取出完整肝臟,濾紙吸干表面水分后稱重,計算肝指數(shù),肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量(g)×100%。(3)完整分離肝臟左葉,用4%多聚甲醛固定,脫水,包埋,切片,HE染色,封固,光鏡下觀察肝組織病理變化并進(jìn)行分級和評分,方法為:在顯微鏡下肝細(xì)胞內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比值為0、<1/3、1/3~2/3、>2/3~1,分別判定為 - (0分)、+(1分)、++(2分)、+++(3分)、++++(4分)[8]。(4)完整分離肝臟中葉,剪取100 mg,測定肝臟TC、TG。肝臟TC、TG測定方法為:取肝組織加9倍體積的異丙醇,在冰水中制成10%的勻漿,4℃提取24 h,3 000 r/min離心10 min,提取上清液,用全自動生化分析儀測定TG、TC含量。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。計量資料以表示,多組間均數(shù)的比較采用方差分析;等級資料的比較采用秩和檢驗。p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 藤茶提取物測定 吸光度法測定純度標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:A=6.21x+0.0105(A為吸光度,x為藥物濃度),R=0.997639。實驗用藤茶提取物二氫楊梅素含量為45.01%。
2.2 肝臟形態(tài)學(xué)觀察及肝指數(shù)變化 正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤,表面光滑,邊緣銳利,包膜完整,質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟顏色呈暗褐色,肝臟腫大,質(zhì)脆,包膜緊張,散在分布白色脂滴,表面均勻分布顆粒狀突起。經(jīng)易善復(fù)或藤茶治療后,小鼠肝臟為褐色,肝臟大小及質(zhì)地較模型組明顯改善,散在少量分布白色脂滴,表面均勻分布顆粒狀突起。
正常對照組、模型組、陽性對照組、藤茶治療組小鼠肝指數(shù)分別為 (41.3±4.1)mg/g、(53.5±3.4)mg/g、(48.5±3.6)mg/g和 (48.7±3.1)mg/g,4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=21.36,p<0.05)。模型組與正常對照組比較,陽性對照組與模型組比較,藤茶治療組與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.01);但陽性對照組與藤茶治療組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05),這兩組與正常對照組比較,差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.01)。
2.3 肝組織病理變化 光鏡下,正常對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝竇清晰可見,肝索排列整齊,肝細(xì)胞無脂肪變性,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。模型組小鼠肝臟呈中或重度脂肪變性,以中央靜脈周圍明顯,肝細(xì)胞腫脹呈圓形,細(xì)胞核被擠向一邊,胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡,脂滴大小不等,甚至融合成大脂滴,界限不清楚。陽性對照組及藤茶治療組小鼠較模型組脂肪變性細(xì)胞明顯減少,脂滴減少或消失,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常 (見圖1)。
圖1 小鼠肝組織切片的形態(tài)改變 (HE染色,×100)Figure 1 Histopa-thological changes of mice liver
根據(jù)肝脂肪變性程度級別標(biāo)準(zhǔn),計算肝脂肪變性評分,4組小鼠肝脂肪變性評分比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=16.40,P=0.00);模型組小鼠肝脂肪變性評分顯著高于正常對照組,陽性對照組和藤茶治療組又顯著低于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.05),但陽性對照組與藤茶治療組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05,見表1)。
2.4 肝功能及血脂變化 模型組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平較正常對照組顯著升高 (p<0.01),陽性對照組和藤茶治療組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平較模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.05);但陽性對照組與藤茶治療組小鼠的上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05,見表2)。
2.5 肝臟TC、TG變化 4組小鼠肝臟組織中TC、TG含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.05);模型組小鼠肝臟組織中TC、TG含量較正常對照組顯著升高 (p<0.01);陽性對照組和藤茶治療組小鼠肝臟組織中TC含量均較模型組顯著降低(p<0.05),與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05);藤茶治療組肝臟TG含量較模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.05);陽性對照組和藤茶治療組TG含量與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.01,見表3)。
表1 4組小鼠肝臟脂肪變性情況比較Table 1 Comparison of degrees of hepatic fatty degeneration among the four groups
表2 4組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較Table 2 Comparison of serum ALT,AST,TC,and TG levels among the four groups
表2 4組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較Table 2 Comparison of serum ALT,AST,TC,and TG levels among the four groups
注:與正常對照組比較,*p<0.01;與模型組比較,△p<0.05,★p<0.01
組別 只數(shù) ALT(U/L)AST(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常對照組 11 48± 7 76±14 2.14±0.25 1.06±0.14模型組 11 162±33* 182±25* 4.12±0.33* 1.32±0.15*陽性對照組 9 110±22*★ 134±21*★ 3.82±0.22*△ 1.11±0.11△藤茶治療組 10 120±14*★ 138±17*★ 3.75±0.20*△ 1.08±0.14△F 值0.00 0.00 0.00 0.0003 51.09 52.84 126.03 8.20 P值
表3 4組小鼠肝組織TC、TG含量比較Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups
表3 4組小鼠肝組織TC、TG含量比較Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups
注:與正常對照組比較,*p<0.01;與模型組比較,△p<0.05
組別 只數(shù) TC(mmol/L) TG(mmol/L)正常對照組 11 0.38±0.08 0.16±0.04模型組 11 0.52±0.03* 0.28±0.05*陽性對照組 9 0.45±0.04△ 0.25±0.01*藤茶治療組 10 0.40±0.11△ 0.21±0.03*△F 值<0.01 <0.01 8.46 21.14 P值
NAFLD是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的,以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征,包括單純性脂肪肝以及由其演變的非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化。隨著人們生活水平的提高及生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,NAFLD在我國的發(fā)病率越來越高,發(fā)病年齡趨向低齡化,已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。
Day和James提出以氧應(yīng)激/脂質(zhì)過氧化為核心的“二次打擊”學(xué)說[9],認(rèn)為:各種狀態(tài)所致的脂肪沉積與胰島素抵抗是脂肪性肝炎的第一次打擊;而氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過氧化是脂肪肝病程進(jìn)展中的第二次打擊,二次打擊是脂肪變性發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。及時去除病因及誘因、減輕肝臟脂肪沉積,抑制氧化應(yīng)激可能是防治脂肪性肝炎的有效措施。
我國藤茶資源豐富,來源廣泛,其有效成分二氫楊梅素含量豐富,實驗采用的藤茶提取物二氫楊梅素的含量為45.01%。本研究發(fā)現(xiàn),藤茶可以明顯改善NAFLD小鼠肝臟脂肪變性,具有潛在的治療NAFLD的作用;還可以降低肝臟TC、TG含量及血清TC、TG、ALT、AST水平,表現(xiàn)出一定的降脂和肝保護(hù)作用。此外,有文獻(xiàn)報道,藤茶還具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化等作用[10]。因此,長期飲用藤茶具有治療NAFLD的功效,其機(jī)制與藤茶抗炎抗氧化、保護(hù)肝臟、減輕肝臟脂質(zhì)沉積有關(guān)。
1 Lu A,Tang Y,Ran R,et al.Brain genomics of intracerebral hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(2):230-252.
2 李翠蘋,曹樹穩(wěn),余燕影.二氫楊梅素研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑,2010,32(7):608-612.
3 方會龍,王俊杰,陳美姿,等.藤茶提取物對血吸蟲病肝纖維化的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué),2010,13(6):2004-2006.
4 鄺滿元,劉映霞,李映菊,等.藤茶總黃酮抗大鼠肝纖維化的作用 [J].南華大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版,2008,36(6):745-747.
5 方會龍,王俊杰,陳美姿,等.二氫楊梅素治療血吸蟲病肝纖維化的實驗研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2010,15(4):381-384.
6 鄺滿元,賈蕾,羅明英.二氫楊梅素對肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標(biāo)的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,8(2):46-47.
7 鄺滿元,賈蕾,羅明英.二氫楊梅素對肝纖維化大鼠脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,6(18):26-28.
8 葛麟,譚正懷,唐大軒,等.輕肝顆粒對小鼠非酒精性脂肪肝的作用研究[J].中藥藥理與臨床,2009,25(2):94-97.
9 Day CP.Steatohepatitis:a tale of two"hits" [J].Gastroenterology,1998,114:842-845.
10 魏來,趙春景.番茄紅素對非酒精性脂肪肝模型大鼠肝細(xì)胞色素P_ (450)2E1及腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響 [J].中國藥房,2010,33(5):3100-3102.