基質(zhì)金屬蛋白酶-9和促血管生成素1、2與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系

張廣宇 焦保華 梁朝輝 何心

基質(zhì)金屬蛋白酶-9和促血管生成素1、2與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系

張廣宇*焦保華 梁朝輝*何心*

目的 研究基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)和促血管生成素(angiopoietin，Ang-1和Ang-2)在垂體腺瘤中的表達(dá)與其侵襲性的相關(guān)性。方法 選取垂體腺瘤手術(shù)標(biāo)本40例，分侵襲組(11例)和非侵襲組(29例)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法對(duì)垂體腺瘤標(biāo)本MMP-9、Ang-1、Ang-2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析。免疫組化方法對(duì)垂體腺瘤標(biāo)本中MMP-9、Ang-1、Ang-2的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果 MMP-9 mRNA在侵襲性垂體腺瘤表達(dá)為1.513±0.28明顯高于非侵襲性垂體腺瘤的0.883±0.245(t=4.61，P＜0.05)，Ang-2 mRNA在侵襲性垂體腺瘤表達(dá)為1.455±0.28明顯高于非侵襲性垂體腺瘤的0.935±0.291(t=4.37，P＜0.05)。MMP-9、Ang-2蛋白在侵襲性垂體腺瘤組中表達(dá)水平明顯高于非侵襲性垂體腺瘤組(T=3.82，T=4.10，P＜0.05)。非侵襲性腺瘤組織Ang-1 mRNA表達(dá)為1.263±0.389明顯高于侵襲性垂體腺瘤的0.889±0.323(t=4.46，P＜0.05)，非侵襲性垂體腺瘤組Ang-1蛋白表達(dá)明顯高于侵襲性垂體腺瘤組(T=5.53，P＜0.05)。Ang-1和Ang-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.68，P＜0.05)，MMP-9、Ang-1與Ang-2在垂體腺瘤中的表達(dá)高低與患者性別、垂體瘤有無分泌功能無關(guān)。結(jié)論 MMP-9和Ang-2在侵襲性垂體腺瘤中的高表達(dá)及Ang-1在侵襲性垂體腺瘤中的低表達(dá)，可能與垂體腺瘤的侵襲性生長有關(guān)。

垂體腺瘤 MMP-9 Ang-1 Ang-2 侵襲性

垂體腺瘤呈局限性生長，一般不發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但部分垂體腺瘤的生長可侵襲周圍腦組織、血管、神經(jīng)，破壞鞍區(qū)骨質(zhì)，表現(xiàn)惡性腫瘤的特性，手術(shù)全切除十分困難，這部分垂體腺瘤被稱之為侵襲性垂體腺瘤?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)可降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜和結(jié)締組織，對(duì)腫瘤新生血管的形成起重要作用［1］。有文獻(xiàn)［2］報(bào)道認(rèn)為MMP-9可以作為侵襲性垂體腺瘤侵襲性的標(biāo)記物之一。促血管生成素 1，2(angiopoietin，Ang 1，2)對(duì)血管發(fā)生、成熟及重塑的作用，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵潤密切相關(guān)［3］。促血管生成素在垂體腺瘤在發(fā)生、生長過程中起重要作用［4］。通過檢測(cè)侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤組織中MMP-9、Ang-1，Ang-2的mRNA和蛋白表達(dá)，探討它們與垂體腺瘤侵襲性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年10月至2009年9月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的垂體腺瘤組織40例，男16例，女24例。平均年齡為(39.90±7.35)歲(17～67歲)。侵襲性垂體腺瘤判斷標(biāo)準(zhǔn):①采用Knosp的放射學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［5］，3級(jí)以上歸為侵襲性腺瘤;②術(shù)中見鞍底骨質(zhì)及硬腦膜被侵襲破壞，腫瘤突入蝶竇腔或侵入鞍旁的血管、神經(jīng);③術(shù)中所取鞍底骨質(zhì)或鄰近硬腦膜經(jīng)病理學(xué)證實(shí)有腫瘤侵犯。符合其中之一者即可確定為侵襲性腺瘤。侵襲性垂體腺瘤11例，其中男6例，女5例。非侵襲性垂體腺瘤29例，其中男10例，女19例。根據(jù)腫瘤有無分泌功能分:生長激素型(GH)11例，泌乳激素型(PRL)17例，非功能性垂體腺瘤12例。將術(shù)中切除的新鮮腫瘤，迅速裝入無菌凍存管，投入液氮。另一部分腫瘤組織置入福爾馬林液固定。主要試劑:兔抗人MMP-9、羊抗人Ang-1、羊抗人Ang-2多克隆抗體(武漢博士德)。RNA提取試劑(Invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄酶，dNTP，Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 按Trizol試劑說明書提取總RNA。cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系15μL。引物的序列:MMP-9引物擴(kuò)增產(chǎn)物307bp，上游引物5'-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3'，下游引物5'-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3'。Ang-1引物擴(kuò)增產(chǎn)物 595bp，上游引物 5'-GGCTTGGTTACTCGTCAGGCTTGGTTACTCGTCA-3V，下游引物 5'-TCAGGCTGCTCTGTTTT-3'。Ang-2引物擴(kuò)增產(chǎn)物288bp，上游引物5'-TGGAAGCCCAAGTATTA-3'，下游引物5'-TATTCACCGTGGCAGTC-3'。β-actin引物擴(kuò)增產(chǎn)物 135 bp，上游引物:5'-CCAACTGGGACGACAT-3'，下游引物5'-TCTGGGTCATCTTCTCG-3'。PCR反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，72℃時(shí)加入Taq酶，擴(kuò)增結(jié)束后滅活Taq酶。產(chǎn)物分析:取25μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，goodview染色，應(yīng)用讀膠儀讀取各條產(chǎn)物帶的光密度值。NIHimage1.61圖像分析軟件掃描分析，計(jì)算目的基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積與β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積的比值，作為目的基因mRNA的相對(duì)含量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，血清孵育，加一抗(1∶100)、二抗、抗鏈霉菌－抗生物素－過氧化酶復(fù)合物、DAB顯色、蘇木精復(fù)染。每次染色均置空白及陽性對(duì)照，以PBS液置換一抗作空白對(duì)照。結(jié)果判定參照IRS(immunoreactive score)半定量法［6］:①染色強(qiáng)度:在高倍鏡下對(duì)細(xì)胞染色評(píng)分，無著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;②陽性范圍:隨機(jī)觀察5個(gè)中倍視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，將各個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)的平均百分比作為該切片的陽性細(xì)胞百分比。5%以下為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、75%以上為4分。上述兩項(xiàng)結(jié)果相乘，0分計(jì)為陰性(－)、1～2分計(jì)為弱陽性(+)、3～6分計(jì)為中等陽性(++)、＞6分計(jì)為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.0進(jìn)行分析，RT-PCR測(cè)得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。MMP-9，Ang-1，Ang-2免疫組化結(jié)果采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，與臨床因素關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 侵襲性組 MMP-9 mRNA，Ang-2 mRNA表達(dá)較非侵襲性組高(t值分別為4.61，4.37;P＜0.05)，見圖1和表1。非侵襲性組Ang-1 mRNA表達(dá)較侵襲性組高(t=4.46;P＜0.05)。MMP-9和Ang-1，MMP-9和Ang-2之間無相關(guān)性(r值分別為0.30，0.38;P＞0.05)。Ang-1和Ang-2之間呈負(fù)相關(guān)(r=－0.68，P ＜0.05)。

圖1 MMP-9，Ang-1 and Ang-2mRNA陽性表達(dá)及相應(yīng)β-actin對(duì)照

表1 RT-PCR方法檢測(cè)MMP-9，Ang-1、Ang-2 m RNA在侵襲性和非侵襲性垂體瘤中表達(dá)

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 MMP-9表達(dá)定位在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞漿(圖2)，Ang-1，Ang-2表達(dá)定位在腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞漿，陽性皆呈棕黃色顆粒(圖3，4)。侵襲性組MMP-9，Ang-2的表達(dá)較非侵襲性組高(T值分別為3.82，4.10，P＜0.05)。非侵襲性組Ang-1表達(dá)較侵襲性組高(T=5.53，P＜0.05)。MMP-9和Ang-1，MMP-9和 Ang-2無相關(guān)性(rs= －0.35，0.55;P＞0.05)。Ang-1和 Ang-2呈負(fù)相關(guān)(rs= －0.80，P＜0.05)(表2)。

圖2 免疫組織化學(xué)反應(yīng)MMP-9陽性細(xì)胞，在侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)(A)和非侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)(B)，腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕色(SP法 ×400)

圖3 免疫組織化學(xué)反應(yīng)Ang-1陽性細(xì)胞，在侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)(A)和非侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)(B)，腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈棕色(SP法 ×400)

圖4 免疫組織化學(xué)反應(yīng)Ang-2陽性細(xì)胞，在侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)(A)和非侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)(B)，腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈棕色(SP法 ×400)

表2 免疫組化方法檢測(cè)MMP-9，Ang-1和Ang-2在侵襲性和非侵襲性垂體瘤中表達(dá)

2.3 垂體腺瘤中MMP-9，Ang-1及Ang-2蛋白表達(dá)與患者臨床特征相關(guān)性比較 三者表達(dá)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與患者性別、垂體腺瘤有無分泌功能無關(guān)(表3)。

表3 MMP-9，Ang-1和Ang-2在垂體腺瘤中表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生存的重要內(nèi)環(huán)境，對(duì)腫瘤要侵襲的周圍組織來說，腫瘤細(xì)胞必須首先突破細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜組成的結(jié)構(gòu)屏障，然后才能向周圍組織侵襲。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞細(xì)胞基底膜，誘導(dǎo)腫瘤新生血管的生成和重塑，促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移［1］。Kawamoto［7］等認(rèn)為，MMP-9 表達(dá)不僅與垂體瘤的侵襲性密切相關(guān)，而且與腫瘤復(fù)發(fā)與否密切相關(guān)。我們的研究表明，侵襲性垂體腺瘤組中MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)高于非侵襲性垂體腺瘤組，表明其在垂體腺瘤的侵襲性生長過程中可能起重要作用，我們的結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道［8］一致。但是，我們的研究結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)MMP-9在侵襲性垂體腺瘤中存在高表達(dá)，與患者性別、垂體瘤有無分泌功能無關(guān)，MMP-9高表達(dá)引起垂體腺瘤周圍基質(zhì)結(jié)構(gòu)降解及其對(duì)基底膜破壞作用的具體分子學(xué)機(jī)制，尚需進(jìn)一步開展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

腫瘤由腫瘤細(xì)胞和血管構(gòu)成，腫瘤細(xì)胞通過分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等特異性因子，引發(fā)周圍組織的血管形成，為腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移提供必須的途徑［9］。通過生物學(xué)手段干擾腫瘤血管的生成，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的已經(jīng)成為抗腫瘤治療的重要手段之一［10］。血管生成素家族包括Ang-1，2，3，4四個(gè)成員，Ang-1表達(dá)于血管周細(xì)胞和壁細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸酶受體Tie-2最主要的激動(dòng)劑，Ang1與Tie-2結(jié)合后，導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途徑活化，能夠維持血管的完整與穩(wěn)定，抑制腫瘤血管生成［11］。Ang-2由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，它是Ang1的天然拮抗劑，作為腫瘤血管新生起始的強(qiáng)化因素，與腫瘤血管生成的數(shù)目和密度、腫瘤大小、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。Ang-2能阻斷Ang-1/Tie-2通路，使血管支持細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的連接松解，并增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF等血管增殖因素的敏感性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、萌芽、遷移，從而促進(jìn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移［13］。我們發(fā)現(xiàn)侵襲性垂體腺瘤組織中Ang-2表達(dá)上調(diào)、伴有Ang1表達(dá)下調(diào)，Ang-2能夠競爭性的抑制Ang-1生物功能，降低血管的穩(wěn)定性，推測(cè)Ang-2增加腫瘤的血供促腫瘤生長作用與Ang-1抑制腫瘤生長作用之間的平衡被打破，可能在侵襲性垂體腺瘤腫瘤血管形成過程中起至關(guān)重要的作用。

Ang-2能夠上調(diào)包括MMP-9在內(nèi)的一些蛋白水解酶的表達(dá)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9，Ang-2mRNA及其蛋白在侵襲性垂體腺瘤中表達(dá)上調(diào)，而Ang-1 mRNA及其蛋白在侵襲性垂體腺瘤組中表達(dá)較低，我們認(rèn)為Ang-1和Ang-2表達(dá)比例失調(diào)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤血管形成，并在MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜共同作用下，在侵襲性垂體腺瘤的侵襲生長中發(fā)揮重要作用。但是MMP-9與Ang-2在侵襲性垂體腺瘤組中的表達(dá)在本組資料中并無相關(guān)性，同樣MMP-9與Ang-1也無相關(guān)性，說明在垂體腺瘤發(fā)生及侵襲過程中，雖然多數(shù)情況下有MMP-9和Ang-2的作用，但可能還有其他因素的參與，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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The study on the association of MMP-9、Ang-1 and Ang-2 with tumor invasive behavior in human pituitary daenomas.

ZHANGGuangyu，JIAO Baohua，LIANG Chaohui，HE Xin.Department of Neurosurgery，the second affiliated Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China.Tel:0311 －87222972.

ObjectiveTo study the expression ofmatrixmetalloproteinase 9(MMP-9)，Angiopoietin-1(Ang-1)and Angiopoietin-2(Ang-2)in pituitary adenomas and explore their relationshipswith tumor invasive behavior.M ethods ThemRNA and protein expression levels of MMP-9，Ang-1 and Ang-2 were determined using RT-PCR assay and immunohistochemical technique in 40 pituitary adenoma tissues samples from surgery，respectively.The samples included 11 invasive pituitary adenomas and 29 non-invasive ones.Results ThemRNA expression levels ofMMP-9 were significantly higher in invasive pituitary adenomas than in non-invasive ones(1.513±0.28 vs 0.883±0.245)(t=4.61，P＜0.05).The mRNA expression levels of Ang-2 in invasive pituitary adenomas were higher than non-invasive ones(1.455±0.28 vs 0.935±0.291)(t=4.37，P＜0.05).The protein expression levels of MMP-9 and Ang-2 were significantly higher in invasive pituitary adenomas than in non-invasive ones(T=3.82＆T=4.10，P ＜0.05).In contrast，themRNA expression levels of Ang-1 mRNA were higher in non-invasive pituitary adenomas than in invasive ones(1.263±0.389 vs0.889±0.323)(t=4.46，P ＜0.05).The protein expression levels of Ang-1 protein were higher non-invasive pituitary adenomas than in invasive ones(T=5.53，P ＜0.05).Both Ang-2 and Ang-1 expression levelswere negatively correlated with pituitary adenomas invasion(r= －0.68，P＜0.05).There were no correlations of MMP-9，Ang-1 and Ang-2 with clinical features(P＞0.05).Conclusions Our study suggests that the expression levels ofMMP9，Ang-1 and Ang-2 may have a value to assess the invasive pituitary adenomas.

Pituitary adenomas MMP-9 Ang-1 Ang-2 Invasion

R651.1

A

* 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科(石家莊 050000)

E-mail:jiaobh2000@163.com)

2010－06－17)

(責(zé)任編輯:甘章平)

·論 著·