KISS-1和MTA-1在侵襲性垂體腺瘤中的表達

杜安東 霍鋼 張鈴鐺 吳留洋 馮清林 唐茂源

KISS-1和MTA-1在侵襲性垂體腺瘤中的表達

杜安東*霍鋼*張鈴鐺*吳留洋*馮清林*唐茂源*

目的 研究腫瘤轉移抑制基因KISS-1和轉移相關基因MTA-1在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中的表達情況，并分析兩者與垂體腺瘤侵襲性的關系。方法 采用免疫組化SP法對31例侵襲性垂體腺瘤和28例非侵襲性垂體腺瘤組織標本KISS-1和MTA-1的蛋白表達進行檢測，RT-PCR法對KISS-1和MTA-1mRNA的表達進行檢測，分析它們在侵襲組和非侵襲組中的表達差異。結果 59例垂體腺瘤患者中，侵襲性垂體腺瘤組KISS-1的蛋白陽性率和mRNA表達均低于非侵襲性垂體腺瘤組(χ2=4.88，t=12.05，P＜0.05)，MTA-1的蛋白陽性率和mRNA表達均高于非侵襲性腺瘤組(χ2=5.43，t=12.99，P＜0.05)。結論 在侵襲性垂體腺瘤組織中KISS-1表達下調、MTA-1表達上調，提示可能與垂體腺瘤的侵襲性密切相關。

垂體腺瘤 KISS-1 MTA-1 侵襲性

垂體腺瘤的侵襲性主要表現在對周圍組織海綿竇、蝶竇、下丘腦、鞍底骨質、鄰近硬腦膜等結構的破壞［1］。因此能否抑制垂體腺瘤的侵襲和術后復發(fā)則成為決定患者預后的關鍵。隨著腫瘤侵襲性研究的不斷深入，人們研究發(fā)現腫瘤轉移抑制基因 (metastasissuppressor gene 1，KISS-1)和轉移相關基因 (metastasis associated gene 1，MTA-1)與腫瘤的浸潤轉移密切相關，在腫瘤侵襲轉移的過程中起著重要的作用［2－6］。因此本研究探討KISS-1和MTA-1與垂體腺瘤侵襲的關系，可能為研究垂體腺瘤侵襲性的機制奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 標本選自2010年3月至2010年9月重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經外科垂體腺瘤患者，實驗均經患者知情同意后進行。其中男26例，女33例，年齡18～67歲，平均41.5歲。59例標本中，28例為非侵襲性垂體腺瘤，31例為侵襲性垂體腺瘤。垂體腺瘤中符合文獻判斷標準［7］之一者即為侵襲性垂體腺瘤。手術時取所需組織，經生理鹽水洗凈積血后，一部分置入4%多聚甲醛溶液內固定，另一部分新鮮腫瘤組織，置入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組織化學檢測(SP法) 采用SP法檢測KISS-1、MTA-1蛋白的表達。組織標本經石蠟包埋5μm連續(xù)切片，1張HE染色用于重新確認病理結果，免疫組化按試劑盒操作說明進行。選擇PBS代替一抗做陰性對照，其余步驟均按說明書進行。在高倍(×400)視野下計算200個腫瘤細胞(隨機計數5個視野，取其平均值)，計算免疫反應陽性的細胞百分比。據免疫組織化學KISS-1及MTA-1反應陽性細胞顯色強度及范圍進行評價［8］:①陰性(－):無陽性細胞染色.②弱陽性(+):陽性細胞小于50%或顯色淺.③強陽性(++):陽性細胞大于50%或顯色深。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析 按Trizol試劑(購自寶生物工程有限公司)說明書提取總RNA，－80℃保存?zhèn)溆?。提取的RNA含量通過752型紫外分光光度計測定260 nm吸收值，按每OD260相當于40 μgRNA計算RNA的產率，OD260在1.8～2.0視為抽提的RNA純度很高。KISS-1上游引物序列5-ACC CTC TGG ACA TTC AC-3，下游引物序列5-CGA AGG AGT TCC AGT TGT-3，產物長度474bp;MTA-1上游引物序列5-AGC TAC GAG CAG CAC AAC GGG GT-3，下游引物序列5-CACGCT TGG TTTCCG AGG AT-3，產物長度為298bp;β-action上游引物序列5-TGA CGTGGA CAT CCG CAA AG-3，下游引物序列5-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GGV3，產物長度200bp(KISS-1、MTA-1 引物均由上海生工生物工程有限公司設計并合成)。RT擴增條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s;PCR擴增條件:94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán) 30 次，72 ℃ 延伸 10 min。分別取5μL產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含0.2 goldview);紫外燈下拍照，采用Quantity-one圖像分析軟件比較電泳條帶光密度值，獲得該樣本KISS-1、MTA-1 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 免疫組化顯色 KISS-1染色顆粒陽性表達定位于細胞漿，有時可見于胞膜，細胞核偶見染色;MTA-1染色顆粒陽性表達定位于細胞漿或細胞核，核仁不染色(圖1)。在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中KISS-1的陽性表達率分別為35.48%(11/28)和64.29%(18/31)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.88，P＜0.05)。在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中MTA-1的陽性表達率分別為54.84%(17)和25.00%(7)，兩組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(χ2=5.43，P ＜0.05)。

2.2 RT-PCR結果 非侵襲性垂體腺瘤組 KISS-1 mRNA表達(0.667±0.075)μg較侵襲性垂體腺瘤組(0.450±0.064)μg高，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.05，P＜0.05)，見圖2;侵襲性垂體腺瘤組中MTA-1mRNA表達(1.353±0.098)μg較非侵襲性垂體腺瘤組(1.005±0.108)μg高，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.99，P＜0.05)見圖3。

圖1 垂體腺瘤組織中KISS-1和MTA-1的蛋白表達。A:侵襲性垂體腺瘤組織HE染色(×400);B:侵襲性垂體腺瘤中KISS-1蛋白的陽性表達(+)(×400);C:侵襲性垂體腺瘤中MTA-1蛋白的陽性表達(+)(×400);D:垂體腺瘤陰性對照(－)(×400)

圖2 KISS-1 mRNA在垂體腺瘤中的表達。1、2、3為侵襲性垂體腺瘤;4、5、6為非侵襲性垂體腺瘤;M為marker

圖3 MTA-1 mRNA在垂體腺瘤中的表達。1、2為侵襲性垂體腺瘤;3、4為非侵襲性垂體腺瘤;M為marker

3 討論

腫瘤侵襲性生長主要與某些基因的過表達或者失活及其相關蛋白、基質金屬蛋白酶等因素相關。隨著腫瘤轉移機制分子生物學的研究深入，人們發(fā)現KISS-1和MTA-1與腫瘤的侵襲轉移相關，那么它們是否在垂體腺瘤的侵襲過程中也起到一定的作用，值得我們重視和探討。

KISS-1基因是定位于染色體lq32，含有4個外顯子，大小為145個氨基酸殘基的親水性蛋白，也稱metastin(或KISS-1肽或轉移抑素)。經研究發(fā)現從黑色素瘤細胞轉移抑制基因KISS-1的產物中分離出的多肽能夠對腫瘤細胞的化學趨向性和侵襲性起到抑制作用［2］。而一些學者在食管鱗狀細胞癌的研究中也發(fā)現KISS-1不僅可以抑制腫瘤細胞的侵襲，還可以抑制細胞的增值［3］。這就提示KISS-1的表達改變可能與眾多腫瘤的侵襲轉移相關。那么KISS-1基因是如何抑制腫瘤侵襲轉移的呢?研究證實KISS-1蛋白通過與受體GPR54結合，然后激活細胞體內磷脂酶C，磷脂酶C產生胞內第二信使IP3和二甘油脂，而IP3可以促進細胞內鈣離子釋放，二甘油脂則可促進蛋白激酶C的活化［9］。細胞內鈣離子濃度的增加可以抑制腫瘤細胞增生，誘導腫瘤細胞分化和凋亡。而蛋白激酶C對細胞分化的調節(jié)起重要作用。KISS-1還可以作用基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)，使其表達下調，本研究小組的前期工作已證實基質金屬蛋白酶系統(tǒng)促進垂體腺瘤的侵襲性［10］，因此，KISS-1也可能通過抑制基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達，從而達到抑制垂體腺瘤細胞侵襲的作用。此外，KISS-1蛋白還參與腫瘤細胞局部粘附和纖維的形成，從而達到抑制腫瘤細胞侵襲轉移的目的。本實驗研究的結果顯示KISS-1蛋白和KISS-1mRNA在侵襲性垂體腺瘤中的表達明顯低于非侵襲性垂體腺瘤，這進一步說明KISS-1基因的表達下調在垂體腺瘤的侵襲中也具有一定作用。

MTA-1是在腫瘤細胞中高度表達上調且具有轉移潛能的基因。目前關于MTA-1與腫瘤侵襲與轉移的關系，學者研究發(fā)現:在前列腺癌［4］、絨毛膜癌［5］、肝癌［6］中，MTA-l的過表達與腫瘤的侵襲轉移、血管侵犯等表型有顯著相關。有研究報道在胰腺內分泌腫瘤中MTA-1基因參與腫瘤的惡性進展和轉移行為，并可作為惡性胰腺內分泌腫瘤轉移潛在的一種生物標志物［11］。我們研究結果顯示，MTA-l蛋白及MTA-1 mRNA在侵襲性垂體腺瘤中的表達明顯高于非侵襲性垂體腺瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義。與其他文獻報道一致，提示MTA-l蛋白高表達可能與垂體腺瘤的侵襲性生長密切相關，可能作為預測垂體腺瘤侵襲性程度的相關標志物。但是，MTA-1增加腫瘤侵襲轉移潛能的分子機制還遠未弄清楚，有待進一步研究。目前認為可能是通過對細胞轉錄水平的調控和參與信號轉導來調節(jié)與腫瘤轉移相關蛋白的水平:MTA-1蛋白通過與組蛋白去乙?；?HDACs)結合，使HDACs到達目的區(qū)域，然后去除組蛋白的乙?；饔糜谌旧|，重塑其結構，使其變得更加緊密而不利于轉錄［12－13］。MTA-1可能就是通過此途徑作用于某些抑制腫瘤浸潤轉移的基因，下調其轉錄，從而增加了腫瘤侵襲轉移的潛在能力。有研究報道，MTA-1蛋白通過p53基因脫乙?；种苝53基因誘導的細胞凋亡［14］，可能增加了腫瘤細胞侵襲轉移潛力。MTA-1還可能通過改變細胞角蛋白絲系統(tǒng)的組裝和細胞骨架蛋白的定位，使腫瘤細胞獲得更具有侵襲性和轉移性的表型［15］。

本研究采用RT-PCR和免疫組化相結合的方法檢測腫瘤轉移抑制基因KISS-1和腫瘤相關基因MTA-1在垂體腺瘤中的表達情況。研究結果表明KISS-1的低表達或缺失和MTA-1的高表達可能與垂體腺瘤的侵襲性生長相關。但腫瘤的侵襲轉移是一個多步驟復雜的生物學過程，目前對KISS-1、MTA-1在腫瘤中如何發(fā)揮生物學功能的具體機制尚未完全清楚。本次研究僅對KISS-1、MTA-1在垂體腺瘤中的作用進行了初步的探討，對于二者在垂體腺瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程中是否存在著必然的相關性還有待于更進一步深入研究。

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The study on the expression of KISS-1 and MTA-1 in invasive pituitary adenomas.

DU Andong，HUO Gang，ZHANG Lingdang，WU Liuyang，FENGQinglin，TANGMaoyuan.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，NO.1 you yi road yuan jia gang，Chongqing 400016，China.Tel:023 －89011157

ObjectiveTo investigate the expression levels of tumormetastasis suppressor gene 1(KISS-1)and metastasis associated gene 1(MTA-1)in invasive and non-invasive pituitary adenomas，and to explore their relationship with the invasiveness of pituitary adenomas.Methods The mRNA and protein expression levels of KISS-1 and MTA-1 were detected using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and immunohistochemical SPmethod in 31 cases of invasive pituitary adenomas and 28 cases of non-invasive pituitary adenomas tissue samples，respectively.Results

In 59 pituitary adenoma cases，themRNA and protein expression levels of KISS-1 were lower in invasive pituitary adenomas than in non-invasive adenomas(χ2=4.88，t=12.05，P ＜0.05)whereas themRNA and protein expression levels of MTA-1 were higher in invasive pituitary adenomas than in non-invasive group(χ2=5.43，t=12.99，P ＜0.05).Conclusions downregulated expression of KISS-1 and upregulated expression of MTA-1 in invasive pituitary adenoma may be closely related to the invasiveness of pituitary adenomas.

Pituitary adenoma KISS-1 MTA-1 Invasiveness

R651

A

* 重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經外科(重慶 400016)

E－mail:xiaomin198171@tom.com)

2011－03－17)

(責任編輯:甘章平)

·論 著·