人橫紋肌樣腦膜瘤細(xì)胞株的分離和鑒定

胡德志 王曉梅 毛穎 周良輔

人橫紋肌樣腦膜瘤細(xì)胞株的分離和鑒定

胡德志*王曉梅*毛穎*周良輔*

目的 人橫紋肌樣腦膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)是一種少見(jiàn)的難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。為建立其體外研究模型，本實(shí)驗(yàn)擬從1例確診的橫紋肌樣腦膜瘤中分離和鑒定橫紋肌樣腦膜瘤細(xì)胞株。方法 利用貼壁培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)結(jié)合的方法，分離細(xì)胞株。利用流式細(xì)胞術(shù)分析表面抗原標(biāo)志。用XTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。用體內(nèi)移植方法評(píng)估其致瘤能力。結(jié)果 分離培養(yǎng)得到一細(xì)胞株，其表面標(biāo)志為CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－Cd34－，與間質(zhì)前體細(xì)胞具有相似性。其在體外具有長(zhǎng)期傳代能力，目前已經(jīng)傳了50余代。體內(nèi)移植試驗(yàn)表明1×105以上細(xì)胞具有較一致的顱內(nèi)致瘤能力，獲得的移植瘤與原發(fā)人腫瘤具有相似的組織學(xué)特征。結(jié)論 我們首次分離了1例具有間質(zhì)細(xì)胞特征并具有致瘤性的橫紋肌樣腦膜瘤細(xì)胞株，為惡性腦膜瘤的研究提供了一個(gè)體外模型。

橫紋肌樣腦膜瘤 細(xì)胞株 間質(zhì)細(xì)胞

橫紋肌樣腦膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)是WHO III級(jí)腦膜瘤的一種類型，是難治性腫瘤，經(jīng)過(guò)手術(shù)切除輔以放、化療治療后，腫瘤仍易復(fù)發(fā)，預(yù)后差［1－3］。目前對(duì)該疾病的臨床和病理特征有一定的研究，但是對(duì)其發(fā)病機(jī)制卻罕有討論。這很可能與缺乏該腫瘤的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀嘘P(guān)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們建立了首例人橫紋肌樣腦膜瘤的細(xì)胞株，為該腫瘤的研究提供了體外模型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究征得患者同意以及復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。新鮮腫瘤標(biāo)本來(lái)自1例59歲的男性橫紋肌樣腦膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)患者。磁共振顯示右中顱底有一注射造影劑后有強(qiáng)化的腫瘤，瘤周有中度水腫。術(shù)中見(jiàn)腫瘤基底在顱底硬膜，腫瘤全切除。術(shù)后切片病理檢查顯示局部有橫紋肌樣變的特征，表現(xiàn)為偏離中心的細(xì)胞核和偏多的嗜酸性染色的細(xì)胞漿。其他區(qū)域見(jiàn)不典型腦膜瘤的特征，包括局部上皮膜抗原(epithelialmembrane antigen，EMA)陽(yáng)性染色，vimentin(VIM)陽(yáng)性染色和高于10%的 Ki-67有絲分裂指數(shù)(圖 1)。GFAP，MNF116，HMB45，S-100，CK，desmin和 SMA染色陰性，可排除膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性肉瘤及不典型畸胎瘤。

圖1 人原發(fā)腫瘤組織學(xué)分析。A:人冠狀位MRI，可見(jiàn)有左中顱底明顯增強(qiáng)的腫塊;B:術(shù)中照片，腫瘤基底在中顱底硬膜;C:人腫瘤標(biāo)本石蠟切片HE染色，見(jiàn)橫紋肌樣細(xì)胞，特征為細(xì)胞核偏中心分布，且胞漿巨大，嗜酸性;D，E，F(xiàn):人腫瘤標(biāo)本免疫組化染色，見(jiàn)腫瘤細(xì)胞局灶性表達(dá)EMA和VIM。Ki-67有絲分裂指數(shù) ＞10%;C，D，E，F(xiàn)(× 400，Scale bar=100 μm)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用的細(xì)胞培養(yǎng)液均為不含血清的DMEM(Gibco)，添加了 N2(1∶100，Sigma)，heparin(5μg/mL，Sigma)，EGF和 bFGF(均為 20 ng/mL，Sigma)，insulin(20 ng/mL，R＆D system)，B27(1%，Invitrogen)，以及 hLIF(100 ng/mL，R＆D system)。新鮮腫瘤組織在去除血管和蛛網(wǎng)膜后，經(jīng)銳性碎化及膠原酶(0.1%，Sigma，37℃)分解后離心(2100 r/min，4℃)，棄上清重懸浮于200μL PBS，所獲得的單細(xì)胞懸液再經(jīng)濾孔直徑為37μm細(xì)胞濾網(wǎng) (Falcon)濾過(guò)。然后將此細(xì)胞接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶，接種密度為1×106細(xì)胞/cm2。24h后將非貼壁細(xì)胞去除，貼壁細(xì)胞3～4 d換液一次。待貼壁細(xì)胞成片后，胰酶消化傳代培養(yǎng)。傳到第四代時(shí)，將貼壁細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移到超低粘附六孔板，進(jìn)行腫瘤球(tumor sphere)培養(yǎng)。細(xì)胞接種密度為3×105個(gè)/cm2。腫瘤球連續(xù)培養(yǎng)至第三代后收集腫瘤球，分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿再行貼壁培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞儀分析 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離培養(yǎng)的細(xì)胞的表面抗原［4］。細(xì)胞先與熒光素結(jié)合的抗體以及同型對(duì)照抗體一起孵育。洗滌后重新懸浮于1 mL HBSS中。在分析前添加 2μL propidium iodide(PI;Calbiochem，100μg/mL)。每種抗原分析重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞動(dòng)力學(xué) 細(xì)胞擴(kuò)增活性用2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5Vsulfop henyl)-5-［(phenylamino)carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide(XTT)法［5］檢測(cè)，并繪制成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 體內(nèi)移植試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。10μL細(xì)胞懸液(含1×102～1×106細(xì)胞)注射到BALB/c裸鼠顱內(nèi)。裸鼠出現(xiàn)明顯的消瘦以及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀時(shí)，處死裸鼠觀察有無(wú)移植瘤形成。移植瘤行切片分析了解其組織學(xué)特點(diǎn)。

1.6 組織病理分析 用HE染色和過(guò)氧化物酶染色法進(jìn)行組織病理分析。石蠟切片脫蠟后在檸檬酸鹽緩沖液(PH 6)中以微波加熱，并以3%BSA封閉非特異性抗體后與一抗(EMA 1∶100，Signet;VIM 1∶200，Covance;SOX2 1∶100，Abgent;Ki-67 1∶100，Saierbio;GFAP 1∶100，Abgent;SMA 1∶100 Abcam，ScienCell;desmin 1∶100，Biolabs;MNF116 1∶100，Abcam;HMB45 1∶100，Abcam;CK 1∶200，Abcam)孵育過(guò)夜，與生物素結(jié)合的二抗作用30 min，再與過(guò)氧化物酶復(fù)合物作用30 min。設(shè)對(duì)照(不加一抗)。

1.7 細(xì)胞染色體分析 按照文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析。利用彩色熒光原位雜交(M-FISH)對(duì)間期、中期染色體進(jìn)行處理、照相，再進(jìn)行核型分析和染色體異常分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株RM-A的分離 我們將原代細(xì)胞接種于添加了上述一些生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基不適合分化細(xì)胞的生長(zhǎng)。20～30 d后，貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成片。3～4代后，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維樣或扁平樣形態(tài)，并觀察到不少腫瘤球樣的細(xì)胞球(圖2A，B)。為了獲得大量的腫瘤球，我們將貼壁細(xì)胞分散制成單細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)種到超低粘附六孔板。15d后觀察到許多懸浮腫瘤球，其直徑介于50～500μm(圖2C，D)。

圖2 原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)。原代腫瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)傳代后，再轉(zhuǎn)移至超低粘附六孔板行腫瘤球培養(yǎng)。A:原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞。在塑料培養(yǎng)瓶里，接種30 d后，貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成片;B:在貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，可以觀察到貼壁的腫瘤球;C，D:在超低粘附六孔板中的懸浮腫瘤球。將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移到超低粘附六孔板中以同樣培養(yǎng)液培養(yǎng)，15 d內(nèi)形成許多懸浮的腫瘤球。(×100，Scale bar=50μm)

將腫瘤球連續(xù)培養(yǎng)，第三代后重新收集于塑料培養(yǎng)瓶中貼壁、擴(kuò)增，該培養(yǎng)系統(tǒng)至今已經(jīng)超過(guò)50代的傳代，倍增時(shí)間約3～4 d。將該細(xì)胞培養(yǎng)物命名為RM-A。XTT法測(cè)得的RM-A細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖所示(圖3)。

2.2 RM-A細(xì)胞表面抗原檢測(cè) 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD59和CD44在所有細(xì)胞表達(dá);CD31，CD11a和CD34在所有細(xì)胞均不表達(dá);CD105表達(dá)率介于18.3%～25.7%(圖4)。除CD105表達(dá)較低，這種表面抗原組合與以往在間質(zhì)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的相似。

2.3 RM-A細(xì)胞致瘤能力 1×105及 以上細(xì)胞注射到裸鼠顱內(nèi)后，可以觀察到致瘤性。接受1×105注射的6只裸鼠，有4只產(chǎn)生了顱內(nèi)腫瘤。而1×104及以下細(xì)胞注射到顱內(nèi)后則沒(méi)有觀察到致瘤性。移植瘤的組織病理分析發(fā)現(xiàn):①橫紋肌樣變;②VIM和 EMA染色陽(yáng) 性;③ GFAP，MNF116，HMB45，S-100，CK，desmin和SMA染色陰性。見(jiàn)圖5。

2.4 RM-A細(xì)胞的染色體異常 對(duì)RM-A的染色體分析發(fā)現(xiàn)有二倍體、四倍體和非整倍體。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)有廣泛的染色體異常，但最常見(jiàn)的是1號(hào)、11號(hào)和22號(hào)染色體異常。見(jiàn)圖6。

圖3 XTT法測(cè)得的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。Error bar表示標(biāo)準(zhǔn)誤

圖5 接種瘤的組織學(xué)分析。A:顱內(nèi)接種RM細(xì)胞后20d產(chǎn)生的接種瘤。B，C，D:裸鼠腦組織切片HE染色，可見(jiàn)橫紋肌樣細(xì)胞。E，F(xiàn):接種瘤石蠟切片免疫組化分析發(fā)現(xiàn)EMA和VIM的局灶性表達(dá)。B(× 10，Scale bar=10μm);C(× 40，Scale bar=20μm);D，E，F(xiàn)(× 400，Scale bar=100μm)

圖6 對(duì)一個(gè)四倍體核型的中期染色體分析結(jié)果:80＜4n＞，XXYY，－1，der(1)t(1;6)(p10;p?10).fishder(1)t(1;6)(wcp1+，wcp6+)，－5，+7，－8，－9，－10，－10，der(11)t(11;20)(q?23;q12).fishder(11)t(11;20)(wcp11+ ，wcp20+)，－ 12，der(12)t(12;y)(?;?).fishder(12)t(12;y)(wcp12+，wcpy+)，－13，－14，－14，－15，－15，der(15)t(12;15)(q?;12q?23).fishder(15)t(12;15)(wcp12+，wcp15+)，der(15)t(12;15)(q?;12q?23).fishder(12)t(12;15)(wcp12+，wcp15+)，+16，－17，－19，－19，－19，－22，+mar1.fishder(?5)t(5;22)(wcp5+，wcp22+)，+mar2.fishder(13)t(13;1;15)(wcp13+，wcp1+，wcp15+)，+mar2.fishder(13)t(13;1;15)(wcp13+ ，wcp1+ ，wcp15+)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。L分別為CD59，CD44，CD105，CD11a，CD31，CD44;R表示同型對(duì)照。

3 討論

作為惡性腦膜瘤的一種亞型，橫紋肌樣腦膜瘤的臨床病理特征已經(jīng)有不少報(bào)告。但是由于缺乏穩(wěn)定的研究模型，限制了對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入研究。而本研究則從1例橫紋肌樣腦膜瘤的新鮮標(biāo)本中分離了具有致瘤性的細(xì)胞株。

迄今為止見(jiàn)于報(bào)道的腦膜瘤細(xì)胞株非常少。良性腦膜瘤由于其細(xì)胞分裂緩慢的特點(diǎn)，其建株必須將細(xì)胞作永生化處理，因此難以反應(yīng)自然的真實(shí)的細(xì)胞活動(dòng)狀態(tài)，在科研活動(dòng)中應(yīng)用價(jià)值不高［7］。目前在研究中應(yīng)用較廣的是Lee等多年前建立的惡性腦膜瘤細(xì)胞株［8］。Lee的細(xì)胞株建立之時(shí)，腦膜瘤的病理分型與如今是有很大不同的。近年腦膜瘤病理分型趨于細(xì)化，增加了諸如橫紋肌樣腦膜瘤等新的病理類型。因此，回頭看Lee的細(xì)胞株，不能確定其來(lái)源腦膜瘤的確切病理類型。本細(xì)胞株的一個(gè)重要特點(diǎn)是，它明確代表了橫紋肌樣腦膜瘤。

本細(xì)胞株另一個(gè)重要特點(diǎn)是其具有間質(zhì)細(xì)胞特征的表面抗原組合。這在以往的腦膜瘤細(xì)胞株中從未見(jiàn)過(guò)描述。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于表明橫紋肌樣腦膜瘤很可能是上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的產(chǎn)物。腦膜瘤被認(rèn)為起源于蛛網(wǎng)膜細(xì)胞。那么，蛛網(wǎng)膜細(xì)胞是如何轉(zhuǎn)化為腦膜瘤細(xì)胞的?有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)纖維瘤病II型(neurofibromatosis type 2，NF2)基因缺失的老鼠中，腦膜瘤發(fā)病率非常高。NF2基因編譯一種被稱為Merlin的蛋白分子，而Merlin的缺失則導(dǎo)致EMT［9］。EMT是許多腫瘤發(fā)生的早期過(guò)程。當(dāng)然，若要證實(shí)橫紋肌樣腦膜瘤是EMT的產(chǎn)物，必須建立蛛網(wǎng)膜細(xì)胞通過(guò)EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為腦膜瘤細(xì)胞的模型，本研究則只是提供了這種推論的一個(gè)重要證據(jù)。

用于建立本細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)方法也有別于其他腦膜瘤細(xì)胞株。即我們采用了目前用于分離腫瘤干細(xì)胞常用的無(wú)血清腫瘤球培養(yǎng)方法。目前，有不少實(shí)體瘤的腫瘤干細(xì)胞均是采用這種方法分離得到的［10］。從采用的方法來(lái)看，我們獲得的細(xì)胞株可能具有腫瘤干細(xì)胞的性質(zhì)。本研究的局限是，尚未對(duì)建立的細(xì)胞株進(jìn)一步進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，多潛能分化誘導(dǎo)試驗(yàn)，以及該腫瘤的其他細(xì)胞群的比較研究，而這些都是鑒定腫瘤干細(xì)胞必需的工作。但是，我們的研究應(yīng)該能說(shuō)明一點(diǎn):即橫紋肌樣腦膜瘤如果存在腫瘤干細(xì)胞，很可能這些干細(xì)胞就屬于表型為CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－Cd34－的細(xì)胞群中。

染色體分析獲得的數(shù)據(jù)，符合既往在腦膜瘤中發(fā)現(xiàn)的染色體異常。良性腦膜瘤常見(jiàn)22號(hào)染色體異常，非良性腦膜瘤染色體異常則更廣泛，尚涉及1號(hào)，11號(hào)等許多染色體。我們所做的核型分析還有一個(gè)意義，說(shuō)明我們的細(xì)胞株不是來(lái)源于腫瘤中所夾雜的正常間質(zhì)性支持組織，因?yàn)檎５拈g質(zhì)支持組織不可能具有如此廣泛的染色體異常。

總之，本研究從橫紋肌樣分離了具有較清晰的表面抗原特征，具有較強(qiáng)致瘤性一個(gè)細(xì)胞群。對(duì)于惡性腦膜瘤的發(fā)病機(jī)制的研究，提供了一個(gè)新的的體外模型。

［1］ Kim EY，Weon YC，Kim ST，etal.Rhabdoidmeningioma:clinical features and MR imaging findings in 15 patients［J］.AJNR Am JNeuroradiol，2007，28(13):1462 －1465.

［2］ Klein R，Bendszus M，Perez J，et al.A new malignant subtype［J］.Pathologe，2002，23(2):297 －302.

［3］ Perry A，Scheithauer BW，Stafford SL，et al.“Rhabdoid”meningioma:an aggressive variant［J］.Am JSurg Pathol，1998 ，22(2):1482－1490.

［4］ Scudiero DA，Shoemaker RH，Paull KD，et al.Evaluation of a soluble tetrazolium，formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines［J］.Cancer Res，1988，48(11):4827 －4833.

［5］ Koide Y，Morikawa S，Mabuchi Y，et al.Two distinct stem cell lineages in murine bone marrow［J］.Stem Cells，2007，25(6):1213－1221.

［6］ Anderson RM，Stevens DL，Goodhead DT.M-FISH analysis shows that complex chromosome aberrations induced by alpha-particle tracks are cumulative products of localized rearrangements［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2002，99(5):12167 －12172.

［7］ Ragel BT，CouldwellWT，Gillespie DL，et al.A comparison of the cell lines used in meningioma research［J］.Surg Neurol，2008，70(3):295 －307;discussion 307.

［8］ Lee WH.Characterization of a newly establishedmalignantmeningioma cell line of the human brain:IOMM-Lee［J］.Neurosurgery，1990，27(3):389 －395;discussion 396.

［9］ KalamaridesM，Niwa-Kawakita M，Leblois H，etal.Nf2 gene inactivation in arachnoidal cells is rate-limiting for meningioma development in themouse［J］.Genes Dev，2002，16(4):1060 －1065.

［10］ Bussolati B，Bruno S，Grange C，et al.Identification of a tumorinitiatingstem cell population in human renal carcinomas［J］.FASEB J，2008，22(5):3696 －36705.

The establishment of human rhabdoid meningioma cell line.

HU Dezhi，WANGXiaomei，MAO Ying，ZHOU Liangfu.Department of Neurosurgery，Huashan Hospital，No.12 Wulumuqizhong Road，Shanghai200040，China.Tel:021 －52889999.

ObjectiveHuman rhabdoid meningioma(RM)is a rare but intractable tumor.To establish amodel for in vitro research，we attempt to establish a cell line from a RM sample.M ethods A combination of plastic adherence method，tumor sphere propagation were employed to establish the cell line.The cell surfacemarker profile，the cell proliferative activity，and the tumorigenic ability of this cell line were examined using flow cytometry analysis，XTT assay，and in vivo experiments respectively.Results The established cell line displayed a CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－CD34－phenotypewhich was similar tomesenchymal progenitors.The cell line has been passed formore than 50 generations so far.In vivo experiments showed that the RM cell line could successfully establish exnograft tumors in nudemicewhen injected at great than 1×105cells intra-cranially.The xenograft tumors exhibited histological features identical to the human original tumor.Conclusions We have successfully established a rhabdoid meningioma cell line with mesenchymal traits and tumorigenic ability from human brain.

Rhabdoid meningioma Cell line Mesenchymal cells

R651

A

* 上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科(上海 200040)

E-mail:yingmao168@hotmail.com)

2011－03－03)

(責(zé)任編輯:甘章平)

·綜 述·