短小芽孢桿菌脂肪酸羥基化發(fā)酵特性與培養(yǎng)條件優(yōu)化

吳立新, 吳祖芳＊

(1.寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江寧波 315211;2.寧波大學生命科學與生物工程學院,浙江寧波 315211)

短小芽孢桿菌脂肪酸羥基化發(fā)酵特性與培養(yǎng)條件優(yōu)化

吳立新1,2, 吳祖芳＊1,2

(1.寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江寧波 315211;2.寧波大學生命科學與生物工程學院,浙江寧波 315211)

利用一株具有轉(zhuǎn)化油酸進行羥基化的短小芽孢桿菌(Bacillus pum ilus)突變株M-F641發(fā)酵生產(chǎn)具有重要功能的ω-羥基脂肪酸。以細胞生長、NADPH生成及油酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為測定指標,研究了培養(yǎng)基的最佳碳源及其發(fā)酵工藝條件;在單因素實驗的基礎上,采用響應面分析法,以油酸轉(zhuǎn)化率作為指標,優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件,并對優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行了驗證。結果表明,最佳碳源為葡萄糖,其最佳初始質(zhì)量濃度為20 g/L,最佳發(fā)酵條件為:溫度30℃、p H 7.4、裝液量60 m L/250 m L。在此條件下油酸轉(zhuǎn)化率為74.58%,ω-羥基脂肪酸產(chǎn)率達22.3%。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下羥基脂肪酸生產(chǎn)效率得到了顯著的提高。

ω-羥基脂肪酸;短小芽孢桿菌M F-641;發(fā)酵條件;響應面法

羥基脂肪酸是指脂肪酸分子中長鏈碳位具有單個或多個羥基的一類有機羧酸[1]。羥基脂肪酸可廣泛應用于金屬潤滑劑、防銹劑、表面活性劑、洗滌劑及食品抑菌劑等方面[2-7]。尤其是ω-1、ω-2和ω-3-羥基脂肪酸因其羥基位置較靠近首位甲基碳端,不但反應性質(zhì)活潑,更重要的是作為單體在合成高分子聚合物時提供最長的單體分子碳鏈,是當今綠色聚合物材料研究開發(fā)中最理想的單體成分之一[4]。目前,國內(nèi)外有關微生物轉(zhuǎn)化生成羥基脂肪酸的報道主要集中在菌種的篩選方面[2-8],而關于發(fā)酵條件對菌株發(fā)酵影響的報道極少[9-10]。

作者在前期研究基礎上[11],利用一株脂肪酸羥基化突變株BPM-F641,研究了羥基脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)的理化參數(shù)(溫度、p H、溶氧水平)的影響及其發(fā)酵特性,在單因素影響的實驗基礎上,進一步通過響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件,并進行發(fā)酵驗證,得到了最佳的發(fā)酵工藝條件,提高了油酸的轉(zhuǎn)化效率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基 短小芽孢桿菌突變株MF641,由作者所在實驗室保藏。

種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基;斜面培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)2%～5%的瓊脂粉;發(fā)酵培養(yǎng)基在種子培養(yǎng)基的基礎上加入0.2 g/dL M n-SO4,底物油酸在發(fā)酵后期(穩(wěn)定生長期)約30 h左右加入[9]。

1.1.2 儀器與試劑 儀器:可見分光光度計,北京普析通用儀器設備責任有限公司產(chǎn)品;Agilent 7890氣相色譜儀,安捷倫公司產(chǎn)品;p H.S-25型數(shù)顯p H計,上海精科儀器廠產(chǎn)品。

試劑:曲拉通 X-100(Triton X-100),油酸均為化學純,國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;葡萄糖,乙醚,棕櫚酸,無水硫酸鈉,濃硫酸,甲醇等均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;正己烷(色譜純),天津市化學試劑研究所;NADPH,色譜純,上海潤成生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵方法

將保藏于4℃冰箱的試驗菌接入斜面培養(yǎng)基中進行活化,于30℃靜置過夜培養(yǎng)(約24 h左右);將活化好的斜面菌種挑取2環(huán)接入種子培養(yǎng)基(裝液量30 mL/250 mL錐形瓶),30℃搖床轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)至20 h,作為種子液。將種子液以體積分數(shù)4%的接種量接入不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行相關分析和測定。

1.3 分析方法

1.3.1 細胞生物量的測定 種子、發(fā)酵培養(yǎng)基中細胞生物量的測定采用分光光度法,在560 nm處測定其光密度[12]。

1.3.2 NADPH標準曲線的建立及胞內(nèi)NADPH含量測定 NADPH標準曲線的建立根據(jù)文獻報道方法[13],用緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.0、0.01 mol/L ED TA、體積分數(shù) 0.05%(V/V)Triton X-100)將NADPH配成0.02～0.1 mmol/L不同濃度范圍溶液,于37℃孵育5 min后用紫外分光光度計在340 nm處測其吸收波長,求得NADPH濃度與吸光度之間的關系,得到回歸方程Y=5.658 6X+0.014 2,相關系數(shù)R2=0.995 8,t檢驗回歸顯著。

短小芽孢桿菌胞內(nèi)NADPH含量的測定:取新鮮發(fā)酵培養(yǎng)的短小芽孢桿菌發(fā)酵液2 m L,于10 000 r/min下離心10 min,得短小芽孢桿菌濕菌體。按1 g∶4 mL加入標準磷酸緩沖液PBS(0.02 mol/L,p H 7.5)。然后再加入液氮進行冰浴超聲波細胞破碎(工作5 s,間隙5 s,工作90次),在處理后的細胞破碎液中加入10 m L緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0,0.01mol/L EDTA,體積分數(shù) 0.05%Triton-X100)并再一次離心(4℃12 000 r/min,離心30 m in)。取離心后的上清液并加入1 m L 4℃0.04 mol/L NaOH于暗處37℃水浴鍋中保溫5 min后立即取出用分光光度計進行NADPH的測定[14],并由標準曲線求出NADPH的含量。

1.3.3 發(fā)酵液中羥基脂肪酸分析及含量測定 取發(fā)酵液50 m L,用9 mol/L的濃硫酸酸化至p H 2.0并加入50 m L乙醚,同時加入棕櫚酸20 mg作為內(nèi)標,通過分液漏斗過濾取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去乙醚,得到發(fā)酵產(chǎn)物。脂肪酸甲酯化采用 H2SO4-甲醇水浴法。

ω-羥基脂肪酸的鑒定按文獻[8]報道的 GC-MS方法;HP7890GC;質(zhì)譜儀 HP5970。ω-羥基脂肪酸含量的測定采用內(nèi)標法,GC分析操作條件如下:以FID檢測器進行檢測;色譜柱條件:DB-WAX(毛細管柱),進樣量為1μL,進樣口溫度250 ℃,檢測器溫度275℃,采用程序升溫法,起始溫度為80℃,保持5 min,然后以20℃/min升至200℃,在此溫度下保持23 min,再以10℃/min升到250℃,保持5 min。載氣:N2(純度 99.99%),流速為 1 m L/min,分流比1∶50。V(H2)∶V(O2)∶V(N2)=40∶450∶30。脂肪酸的轉(zhuǎn)化率與ω-羥基脂肪酸的得率由以下公式表示[9]。

1.3.4 單因素實驗 將種子液以體積分數(shù)4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,并將底物油酸在發(fā)酵后期(約30 h左右)加入培養(yǎng)基中,研究裝液量、培養(yǎng)溫度和p H對BP M-F641生長以及油酸轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.5 響應面分析實驗 依據(jù)裝液量、溫度、p H值等單因素對油酸轉(zhuǎn)化發(fā)酵工藝條件的影響,并根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理,以A(裝液量)、B(溫度)和C(p H)為自變量,以油酸轉(zhuǎn)化率為響應值,設計了3因素3水平的響應面分析實驗;實驗因素和水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of RSM

2 結果與討論

2.1 搖瓶培養(yǎng)條件下細胞生長曲線的測定

為研究BP M-F641在搖瓶培養(yǎng)條件下,碳源種類及其濃度對菌株生長的影響情況,通過測定A值得到發(fā)酵過程生長曲線,其結果如圖1所示,由結果可知BPM-F641在培養(yǎng)至6 h左右開始進入對數(shù)生長期,在20～30 h時處于穩(wěn)定期,30 h以后開始進入衰亡期。

2.2 碳源種類對菌體生長及油酸轉(zhuǎn)化率的影響

圖1 BPM-F641的細胞生長曲線Fig.1 Cell growth curve of BPM-F641

由于微生物對不同碳源的代謝能力不相同,不同的碳源對菌體的生長和產(chǎn)物的合成會有很大影響,足量的微生物細胞是獲得高油酸轉(zhuǎn)化率的必要條件。因此,選擇合適的碳源對微生物生長和發(fā)酵積累目標代謝產(chǎn)物是十分有用的。分別選擇質(zhì)量濃度為20 g/L的葡萄糖、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉作為碳源,考察了不同碳源對BPM-F641細胞生物量以及轉(zhuǎn)化油酸生成ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響,其結果如表2。

表2 碳源種類對菌體生長和ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響Tab.2 Effects of carbon source on the bacteria growth and ω-HFA production

由表2結果可知,以葡萄糖、果糖、麥芽糖和可溶性淀粉分別作為碳源的培養(yǎng)基中,BPM-F641的最大細胞生物量(A值)分別為1.226、0.680、0.618和0.345,可以看出在以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中菌株生長最好,此時油酸的轉(zhuǎn)化率也達到最大為71.1%。這可能與葡萄糖的性質(zhì)有關,因為葡萄糖是最易為微生物所利用的碳源,它可以加速微生物的生長,另外,細胞色素 P450單氧酶系在羥基化油酸生成ω-羥基脂肪酸的過程中需要NADPH的參與,而菌體在消耗葡萄糖的過程中正好能提供充足的NADPH來滿足其需要;其它的碳源可能不易為短小芽孢桿菌所利用,油酸的轉(zhuǎn)化率也較低。

2.3 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對菌體生長及油酸轉(zhuǎn)化率的影響

由2.2結果可知,葡萄糖是BPM-F641生長最佳碳源,進一步采用不同的葡萄糖初始質(zhì)量濃度來考察其初始質(zhì)量濃度對BP M-F641細胞生物量及轉(zhuǎn)化油酸生產(chǎn)ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響,結果如表3。

表3 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對菌體生長和ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響Tab.3 Effects of glucose concentration on the bacteria growth andω-HFA production

由表3結果可知,在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L的培養(yǎng)基中,BP M-F641有最大的細胞生物量,此時的A值為1.212,并且在此培養(yǎng)條件下,ω-羥基脂肪酸得率和油酸轉(zhuǎn)化率也都達到最大分別為21.5%和73.2%;當初始葡萄糖質(zhì)量質(zhì)量濃度為40 g/L時,可能由于滲透壓增大,不利于提高氧的傳遞速度,對菌體生長不利,羥基化反應也受阻遏;當初始葡萄糖濃度過低(10 g/L)時,葡萄糖消耗迅速,同樣不利于菌體的大量生長,也影響到油酸的轉(zhuǎn)化率。

2.4 培養(yǎng)溫度對菌體生長及油酸轉(zhuǎn)化率的影響

采用不同的培養(yǎng)溫度(28、30、32、34℃)來考察溫度對BPM-F641細胞生長及ω-羥基脂肪酸轉(zhuǎn)化率的影響,結果如表4。

表4 培養(yǎng)溫度對ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量影響Tab.4 Effects of temperature on the bacteria growth andω-HFA production

由表4結果可知,當培養(yǎng)溫度由28℃提高至30℃時候,菌體的最大A值也由1.105增加至1.232,但隨著培養(yǎng)溫度的進一步上升,此時的A值開始逐漸減小;同時隨著溫度的上升,ω-羥基脂肪酸得率和油酸轉(zhuǎn)化率先提高后呈下降趨勢,因此,采用30℃的培養(yǎng)溫度有利于菌體的生長,在此溫度下ω-羥基脂肪酸得率和油酸轉(zhuǎn)化率也分別達到最大值為18.5%和69.4%。

2.5 培養(yǎng)基初始p H值對菌體生長及油酸轉(zhuǎn)化率的影響

初始p H值影響菌體對基質(zhì)的利用速率和細胞結構狀態(tài),以致影響菌體生長速度和代謝產(chǎn)物的變化。檢測不同初始p H 值(7.2、7.4、7.6、8.0)條件下BP M-F641的生長情況以及轉(zhuǎn)化油酸生成ω-羥基脂肪酸轉(zhuǎn)化率的影響,其結果如表5。

表5 培養(yǎng)基初始pH值對ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量影響Tab.5 Effects of the initial pH onω-HFA production

由表5結果可知,在初始p H由7.2上升至7.4的過程中,BP M-F641菌體生物量增加,在p H為7.4時細胞生長良好,此時菌體有最大A值為1.234,并且ω-羥基脂肪酸得率和油酸轉(zhuǎn)化率也達到最大值,分別為19.3%和70.2%,但隨著p H的不斷增大,細胞最大A值和油酸轉(zhuǎn)化率都呈現(xiàn)下降趨勢,這可能是p H值的增加對菌體的生長和相關酶的活性產(chǎn)生了比較明顯的抑制作用,從而對油酸的轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生較大的影響。

2.6 裝液量對菌種轉(zhuǎn)化油酸生成ω-羥基脂肪酸得率的影響

利用BPM-F641生產(chǎn)ω-羥基脂肪酸過程中溶氧是一個重要的條件,作者通過裝液量來調(diào)節(jié)搖瓶發(fā)酵中的溶氧量,考察了溶氧條件對細胞生長、NADPH生成及目標產(chǎn)物生成的影響。搖瓶(250 m L)裝液量分別為 30、50、70、90 m L,按相同的實驗條件,測定BP M-F641生物量、輔酶NADPH含量以及轉(zhuǎn)化油酸生成ω-羥基脂肪酸轉(zhuǎn)化率的影響,實驗結果如表6。

表6 裝液量對細胞生長 NADPH含量及ω-羥基脂肪酸產(chǎn)量的影響Tab.6 Effects of the medium size on cell growth,NADPH content andω-HFA production

由表6結果可知,當裝液量由30 m L增大至90 m L時,細胞的最大生物量A值逐漸減小,從最初的1.346降至0.536,這可能是因為隨著裝液量的增加,溶氧量逐漸減小。雖然在30 m L裝液量細胞有最大生物量,但從實際工業(yè)化生產(chǎn)的角度來考慮,減小裝液量顯然是不經(jīng)濟的,綜合考慮,選定以50m L裝液量進行發(fā)酵實驗。而且在此裝液量下,ω-羥基脂肪酸得率和油酸轉(zhuǎn)化率也有最大值,分別是20.1%和71.5%。

根據(jù)對測定的NADPH濃度變化規(guī)律進行分析可知,在以葡萄糖為底物進行發(fā)酵的過程中,NADPH的生成主要在 HM P途徑的氧化階段,需要經(jīng)過葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶等3種脫氫酶的催化反應[18],從這個角度出發(fā),NADPH的生成應該在高溶氧水平進行,實驗結果與該觀點基本一致。

2.7 響應面分析實驗結果

2.7.1 回歸方程的建立與分析 響應面分析的結果見表7,采用Design-Expert 7.0.0 Trial軟件的ANOVA程序,進行二次回歸分析,計算出上述方程各項系數(shù)并進行方差分析(見表7-表9),得到油酸轉(zhuǎn)化率 Y對裝液量、溫度以及p H的標準回歸方程為:

Y=73.50+5.28A+1.50B-0.079C+1.93AB-0.030AC-2.06BC-6.83A2-7.85B2-6.59C2

式中,Y為油酸轉(zhuǎn)化率的預測值,A、B、C為上述3個自變量的編碼值。

表7 響應面設計方案和實驗結果Tab.7 Design program and experimental results of RSM

表8 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Tab.8 Significance test of regression equation module

從表8的方差分析可以看出,所得回歸方程極顯著(P<0.000 1),且失擬檢驗不顯著(P=0.865 2),說明此回歸模型理想,可信度較高。用方程Y擬合3個因素與油酸轉(zhuǎn)化率之間的關系是可行的。模型校正系數(shù)(Adj R-Squared)為0.998 6,說明該模型能解釋99.86%的油酸轉(zhuǎn)化率變化。模型精密度(Adeq Precision)為89.100>4,說明實驗精度很高。Pred R-Squared=0.997 0與 Adj R-Squared=0.998 6值較接近,說明實驗預測值在可信區(qū)間內(nèi)。綜合以上分析得知:該模型與實際情況擬合較好,可用于預測油酸轉(zhuǎn)化率的變化情況。

回歸方程的一次項A和B均對油酸轉(zhuǎn)化率有極顯著影響,C對油酸轉(zhuǎn)化率有顯著影響,3個因素的影響順序依次是A>B>C。此外,二次項A2、B2和C2以及交互項中的A＊B、B＊C對油酸轉(zhuǎn)化率也有顯著的影響,這表明各個實驗因素對轉(zhuǎn)化率的影響呈二次關系,且3個因素之間存在交互作用。

2.7.2 培養(yǎng)因素間交互作用分析與發(fā)酵條件的優(yōu)化 在模型中分別固定裝液量(A,m L)、溫度(B,℃)及p H(C,p H值)中的一個因素在0水平,得到另外兩個因素交互作用對油酸轉(zhuǎn)化率(Y)的子模型,并根據(jù)模型分別繪制三維曲面圖及等高線圖 ,見圖 2～4。

圖2 油酸轉(zhuǎn)化率(Y)的響應曲面和等高線圖f(A,B)Fig.2 Response surface and contour of the bioconversion Y of oleic acid f(A,B)

圖2是裝液量為零水平時,溫度與p H交互影響油酸轉(zhuǎn)化率的曲面圖及等高線圖,從圖中可以直觀地看出培養(yǎng)溫度與p H交互作用顯著;圖3是溫度為零水平時,裝液量與p H交互影響油酸轉(zhuǎn)化率的曲面圖及等高線圖。可以直觀地看出裝液量與p H交互作用顯著;圖4是p H為零水平時,裝液量與溫度交互影響油酸轉(zhuǎn)化率的曲面圖及等高線圖,可以直觀地看出裝液量與溫度交互作用顯著。

綜上所述,由二次多項回歸方程得出3個因素的最佳值為裝液量58.2 mL/250 mL、溫度30.3℃,p H 7.4,油酸轉(zhuǎn)化率的預測值為74.69%。

2.7.3 驗證實驗 采用上述優(yōu)化后的發(fā)酵工藝條件,選用裝液量為60 mL(近似值)/250 m L,溫度30℃,p H值7.4進行發(fā)酵驗證實驗,測得油酸轉(zhuǎn)化率為74.58%與預測值(74.69%)接近,說明該實驗模型可操作性高。

圖3 油酸轉(zhuǎn)化率(Y)的響應曲面和等高線圖f(A,C)Fig.3 Response surface and contour of the bioconversion Y of oleic acid f(A,C)

圖4 油酸轉(zhuǎn)化率(Y)的響應曲面和等高線圖f(B,C)Fig.4 Response surface and contour of the bioconversion Y of oleic acid f(B,C)

3 結 語

通過單因素實驗和響應面優(yōu)化分析,得出短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化油酸生成ω-羥基脂肪酸的最佳碳源是葡萄糖,其最佳初始質(zhì)量濃度為20 g/L;最佳發(fā)酵條件是:反應溫度30℃、p H值7.4,裝液量60 m L,在優(yōu)化工藝條件下進行的驗證實驗,油酸的轉(zhuǎn)化率高達74.58%;驗證實驗所得的油酸轉(zhuǎn)化率數(shù)值與預測值接近,從而證實了回歸方程的有效性。

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Fermentation Characters of Fatty Acids Hydroxylation and Optimization of Culture Conditions by Bacillus pumilus

WU Li-xin1,2, WU Zu-fang＊1,2
(1.Key laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,Ningbo 315211,China;2.Ministry of Education,Faculty of Life Science and Biotechnology,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

A mutated strain of Bacilluspumilus M-F641 was used for production ofω-hydroxy fatty acids(ω-HFA)by bio-conversion of oleic acid.The optimum carbon source of the medium and fermentation conditions were investigated for the cell grow th,NADPH content and conversion yield of oleic acid as index.On the basis of single facto r experiment,the optimal fermentation condition was obtained by response surface methodology,using the oleic acid conversion rate as index.Further experiment was conducted under the optimal culture condition.The optimum conditions were listed as follow s:the glucose concentration 20 g/L,the environmental conditions were 30℃,p H 7.4 and 60 m L in 250m L flask,respectively.Under the optimum conditions,oleic acid transformation yield was achieved at 74.58%,and the ratio ofω-HFA with total oleic acid was 22.3%.ω-HFA production yield was significantly imp roved under the optimized fermentation conditions.

book=603,ebook=282

ω-hydroxy fatty acid,Bacillus pum ilusM-F641,fermentation condition,response surface method

TQ 920.1

A

1673-1689(2011)04-0602-07

2010-07-10

國家自然科學基金項目(30840012)。

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吳祖芳(1963-),男,浙江奉化人,工學博士,教授,主要從事食品生物技術研究。Email:w uzufang06@yahoo.com.cn