白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶體外抑制活性的動(dòng)力學(xué)研究

楊 陽(yáng), 魯 軍, 孫冰潔, 王 丹, 尹曉燕, 任迪峰＊

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100027)

白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶體外抑制活性的動(dòng)力學(xué)研究

楊 陽(yáng)1, 魯 軍2, 孫冰潔1, 王 丹1, 尹曉燕1, 任迪峰＊1

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100027)

在30℃,p H 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4的緩沖體系中,采用酶促動(dòng)力學(xué)方法,研究了白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制作用。結(jié)果表明,白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶、單酚酶和二酚酶均有抑制作用,對(duì)單酚酶抑制活性的IC50值(抑制率達(dá)到50%時(shí)的白藜蘆醇質(zhì)量濃度)約為5.1 mg/m L,對(duì)二酚酶抑制活性的IC50值約為5.6 mg/m L。此外,白藜蘆醇可延長(zhǎng)單酚酶的遲滯效應(yīng),8 mg/mL的白藜蘆醇能使遲滯時(shí)間從22 s延長(zhǎng)至62 s,而對(duì)二酚酶則無此遲滯作用。Lineweaver-Burk圖分析表明,白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為混合型抑制,對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)和對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)分別為3.4 mg/m L和35.98 mg/m L。

白藜蘆醇;酪氨酸酶;抑制活性;酶促動(dòng)力學(xué)

酪氨酸酶(Tyrosinase)是由二價(jià)銅離子與酶蛋白結(jié)合的金屬酶,是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶[1,2],可催化含酚基化合物(如酪氨酸、酚類化合物等)氧化成多巴醌,經(jīng)一系列中間反應(yīng)后形成黑色素,而黑色素的合成、分布與哺乳動(dòng)物皮膚、毛發(fā)的色素沉積直接相關(guān)[3,4],與果蔬褐變也有著有重要的關(guān)系[5]。因此,通過篩選合成酪氨酸酶抑制劑,抑制酪氨酸酶的活性來控制黑色素的合成,已成為防止果蔬褐變、色斑治療及美白化妝品研制的一種重要途徑。

由于天然植物資源來源廣泛、安全性高,從植物來源中分離提取正成為開發(fā)酪氨酸酶抑制劑的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外已有研究從多種植物中分離出效果顯著的黃酮多酚類酪氨酸酶抑制劑,如山奈酚[6,7]、檞皮素[8,9]、花蜜粉提取物等[10]。白藜蘆醇是一種二苯乙烯類化合物,在自然界分布廣泛,其中以虎杖、葡萄、花生等植物中含量居多。作為一種天然產(chǎn)物,白藜蘆醇對(duì)人體有著重要的生理和醫(yī)療保健功能,如抗癌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂代謝、保護(hù)心血管、抗氧化、消炎、保肝、雌激素調(diào)節(jié)等作用[11]。然而,目前仍未見有關(guān)其酪氨酸酶抑制活性的研究報(bào)告。作者對(duì)白藜蘆醇的酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行測(cè)定,以白藜蘆醇為效應(yīng)物,研究其對(duì)酪氨酸酶催化活性的影響,從而為推進(jìn)白藜蘆醇在功能性食品和祛斑、美白化妝品等醫(yī)藥制劑上的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蘑菇酪氨酸酶(比活力4276 U/mg)、3,4-二羥基苯氨酸(L-DOPA)、L-酪氨酸:購(gòu)自美國(guó) Sigma化學(xué)公司;白藜蘆醇:購(gòu)自中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng);二甲基亞砜(DM SO)、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉:購(gòu)自北京藍(lán)弋化學(xué)試劑公司;蒸餾水:為去離子重蒸水。

752型紫外可見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品;恒溫箱:北京蘇瑞試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 單酚酶活力的測(cè)定

酪氨酸酶催化L-酪氨酸、L-DOPA的產(chǎn)物多巴色素在475 nm處有最大吸收。用酪氨酸酶多巴速度氧化法,通過測(cè)定酶催化反應(yīng)體系的A475nm隨時(shí)間的增長(zhǎng)直線,從直線斜率即可求得酶活力。以1.5 mmol/L L-酪氨酸為底物。先將 0.9 m L 5 mmol/L L-酪氨酸溶于磷酸鹽緩沖溶液(p H 6.8)于比色杯中,加入 1.92 m L磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8),在30℃恒溫箱中恒溫10 min,然后加入0.12 m L不同濃度的白藜蘆醇溶液(溶于DM SO)和0.06 m L 0.232 g/L酪氨酸酶水溶液,混勻,立即測(cè)定A475nm。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣,以沒有加酪氨酸酶的為空白樣。在此測(cè)活體系中,酶的終質(zhì)量濃度為4.64 mg/L。

1.3 二酚酶活力的測(cè)定

以1.5 mmol/L L-DOPA為底物。先將0.9 m L 5 mmo l/L L-DOPA溶于磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8)于比色杯中,加入1.86 mL磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8),在30℃恒溫箱中恒溫10 min,然后加入0.12 m L不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇溶液(溶于DM SO)和0.12 m L 0.232 g/L酪氨酸酶水溶液,混勻,立即測(cè)定A475。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣,以沒有加酪氨酸酶的為空白樣。在此測(cè)活體系中,酶的終質(zhì)量濃度為9.28 mg/L。

式中:A1是含有底物、酪氨酸酶、白藜蘆醇的測(cè)活體系反應(yīng)4 min時(shí)的吸光度值;A2是含有底物、酪氨酸酶,但不含白藜蘆醇的測(cè)活體系反應(yīng)4 m in時(shí)的吸光度值;A0是含有底物,但不含酪氨酸酶、白藜蘆醇的測(cè)活體系反應(yīng)4 min時(shí)的吸光度值。

1.4 酶促動(dòng)力學(xué)分析

研究白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶的抑制作用類型,以L-DOPA為底物,在測(cè)活體系中,固定酶的質(zhì)量濃度,通過改變底物L(fēng)-DOPA的濃度,測(cè)定不同質(zhì)量濃度白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶活力的影響,并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進(jìn)行酶促動(dòng)力學(xué)分析。在4 m L的比色皿中,加入濃度分別為0.25、0.5、1、2 mmol/L的L-DOPA溶于磷酸鹽緩沖溶液(p H 6.8)0.9 m L,再加1.86 m L的磷酸緩沖液,在30℃恒溫箱中恒溫10 min,白藜蘆醇(溶于DMSO)以不同濃度(0、2、4、6 和 8 mg/mL)各取 0.12 m L放入比色皿中,最后加入酪氨酸酶水溶液,立即混勻,連續(xù)記錄6 min內(nèi)的吸光度值。以反應(yīng)速度倒數(shù)(1/v)對(duì)底物濃度的倒數(shù)(1/Cs)作圖,得到Lineweaver-Burk圖,對(duì)白藜蘆醇的抑制類型進(jìn)行分析,比較酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù),包括米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速率(Vm)。并以Lineweaver-Burk圖中各直線斜率和縱軸截距分別對(duì)白藜蘆醇濃度二次作圖,進(jìn)而求得白藜蘆醇對(duì)游離酶和對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶活力的影響

圖1為不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進(jìn)程曲線,反應(yīng)剛開始時(shí)產(chǎn)物生成緩慢,此為遲滯期,到一定時(shí)間后,反應(yīng)速度直線上升達(dá)到恒定的速率,到達(dá)穩(wěn)定態(tài),穩(wěn)定態(tài)即為直線部分,遲滯時(shí)間為直線部分交于橫軸的截距。

圖1 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進(jìn)程曲線Fig.1 Time-course curve for inhibitory effect of resveratrol on the monophenolase activity of tyrosinase

圖1結(jié)果表明,白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性有抑制作用,能延長(zhǎng)單酚酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間,并隨白藜蘆醇濃度的增大,遲滯時(shí)間延長(zhǎng),穩(wěn)態(tài)酶活力下降。遲滯效應(yīng)是酪氨酸酶催化氧化酪氨酸的典型特征。有研究表明,遲滯時(shí)間的長(zhǎng)短取決于反應(yīng)溶液中酶和底物的濃度,另外,加入過度金屬離子或者二酚可縮短甚至消除遲滯效應(yīng)[12]。

圖2 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶相對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the relative monophenolase activity of tyrosinase

圖2為不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇對(duì)穩(wěn)態(tài)酶活力和遲滯時(shí)間的影響,結(jié)果表明,隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大,遲滯時(shí)間明顯延長(zhǎng):未加白藜蘆醇時(shí),遲滯時(shí)間為22 s;當(dāng)加入8 mg/m L的白藜蘆醇時(shí),遲滯時(shí)間延長(zhǎng)至62 s,遲滯時(shí)間幾乎增加至原來的3倍,同時(shí)穩(wěn)態(tài)酶活力下降了67.4%,可以看出,白藜蘆醇具有較大的酪氨酸酶單酚酶抑制活性,IC50值約為5.1 mg/m L。

2.2 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響

圖3為不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進(jìn)程曲線。結(jié)果表明,酪氨酸酶催化氧化L-DOPA的進(jìn)程曲線是通過原點(diǎn)的直線,不存在遲滯效應(yīng),隨著加入的白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大,直線的斜率下降,即表明二酚酶催化氧化的速率降低,酶活力下降,白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性有抑制作用。

圖3 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制作用的進(jìn)程曲線Fig.3 Time-course curve for inhibitory effect of resveratrol on the disphenolase activity of tyrosinase

圖4為不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制效應(yīng)的進(jìn)程曲線,反應(yīng)進(jìn)程是通過原點(diǎn)的直線,二酚酶催化L-DOPA不存在遲滯效應(yīng),結(jié)果表明,隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大,相對(duì)酶活力下降,當(dāng)加入8 m g/m L的白藜蘆醇時(shí),酶活力下降了66.1%,可以看出,白藜蘆醇具有較大的酪氨酸酶二酚酶抑制活性,IC50值約為5.6 mg/m L。

圖4 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶二酚酶相對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effects of resveratrol on the relative diphenolase activity of tyrosinase

2.3 白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶的抑制類型

根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷抑制類型,通過作圖得到一組相交于第二象限的直線,說明白藜蘆醇作為抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為混合型抑制,即加入的白藜蘆醇不僅可以影響酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度(Vm),還可以影響米氏常數(shù)(Km):隨著白藜蘆醇濃度的增大,Km值增大Vm值下降,說明白藜蘆醇既能與游離酶(E)結(jié)合,又能與酶-底物絡(luò)合物(ES)結(jié)合。

二次作圖,分別以各直線斜率對(duì)白藜蘆醇質(zhì)量濃度作圖及以各直線與縱軸截距對(duì)白藜蘆醇質(zhì)量濃度作圖得到回歸直線[13],分別求得白藜蘆醇對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)為3.35 mg/mL,對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)為35.98 mg/m L。

3 結(jié) 語(yǔ)

白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶均有抑制作用,對(duì)單酚酶的抑制作用主要表現(xiàn)為酶催化反應(yīng)遲滯時(shí)間的延長(zhǎng),8.0 mg/mL的白藜蘆醇可使單酚酶的遲滯時(shí)間幾乎延長(zhǎng)至原來的3倍,同時(shí)穩(wěn)態(tài)酶活性也下降了80%;對(duì)酪氨酸酶的抑制作用表現(xiàn)為混合型抑制,對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)為3.35 mg/mL,對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)為35.98 mg/m L。白藜蘆醇對(duì)抑制單酚酶、二酚酶活性的IC50值分別約為5.1 mg/mL和5.6 mg/mL。

白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為白藜蘆醇作為酪氨酸酶抑制劑提夠了理論支持,為新型酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)應(yīng)用提供了新途徑。此外,白藜蘆醇作為天然產(chǎn)物,來源豐富、安全性高。它不但可用于色素增加性皮膚病(黃褐斑、雀斑等)的臨床治療,而且可用于化妝品使膚色增白,還有可能應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上作為一種害蟲調(diào)控劑和食品工業(yè)上作為食品添加劑[14],成為預(yù)防果蔬褐變和治療各種色素病的良好制劑[15],具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。

（References）：

[1]Fenol L G,Penalverm J,Rodriguez-Lopez J N,et al.Tyrosinase kinetics:discrimination between two models to exp lain the oxidation mechanism of monophenol and diphenol substrates[J].The International J of Biochem&Biology,2004,36(2):235-246.

[2]Kubo I,Chen Q X,Nihei K,et al.Molecular design of antibrowning agents:antioxidative tyrosinase inhibitors[J].Food Chemistry,2003,81(2):241-247.

[3]Seiberg M,Paine C,Sharlow et al.Inhibition of melanosome transfer results in skin lightening[J].Invest Dermatol,2000,115:162-167.

[4]Schaffer J V,Bolognia J L.Themelanocortin-1-receptor:red hair and beyond[J].Arch Dermatol,2001,137:1477-1485.

[5]Masuda T,Yamashita D,Takeda Y,et a1.Screening for tyrosinase inhibitors among extracts of seashore plants and identification of potent inhibitors fromGarcinia subelliptica[J].Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,2005,69(1):197-201.

[6]Kubo I,Yokokawa Y.Two tyrosinase inhibiting flavonol glycosides fromBuddleiacoriacea[J].Phytochemistry,1992,31:1075-1077.

[7]Kubo I,Kinst-Hori I.Flavonols from saffron flower:tyrosinase inhibitory activity and inhibition mechanism[J].Agric Food Chem,1999,47:4121-4125.

[8]Kubo I,Kinst-Hori I,Yokokawa Y.Tyrosinase inhibitors from Anacardium occidentale fruits[J].Nat Prod,1994,57:545-551.

[9]Chen Q X,Kubo I.Kinetics of mushroom tyrosinase inhibition by quercetin[J].Agric Food Chem,2002,50:4108-4112.

[10]張紅成,李春陽(yáng),董捷,等.8種蜂蜜粉醇提物對(duì)酪氨酸酶的單酚酶氧化活性的抑制作用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,1(28):14-17.ZHANG Hong-cheng,LI Chun-yang,DONGJie,et al.Inhibiting effect of ethanolic extracts of eight kinds of bee pollens on the activity of tyrosinase to oxidizemonophenol[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2009,1(28):14-17(in Chinese).

[11]Mokni M,Elkahoui S,Limam F,et al.Effect of resveratrol on antioxidant enzyme activities in the brain of healthy rat[J].Neurochemical Research,2007,32(6):981-987.

[12]Cabanes J,Garcia C F,Lozano J A,et al.A kinetic study of the melanization pathway between L-tyrosinase and dopachrome[J].Biochem Biophys Acta,1987,(790):101-107.

[13]Robit C,Rouch C,Cadet F.Inhibition of palmito(Acanthophoenix rubra)polyphenol oxidase by carboxylic acids[J].Food Chemistry,1997,59(3):355-360.

[14]鄒先偉,蔣志勝.植物源酪氨酸酶抑制劑研究進(jìn)展[J].中草藥,2004,35(6):702-705.

ZOU Xian-wei,JIANG Zhi-sheng.Advance in studies on botanical inhibitors of tyrosinase[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2004,35(6):702-705(in Chinese).

[15]陳清西,林建峰,宋康康.酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,46(2):274-281.

CHEN Qing-xi,LIN Jian-feng,SONG Kang-kang.Development of tyrosinase inhibitors[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2007,46(2):274-281(in Chinese).

Inhibitory Kinetics Study of Resveratrol on Tyrosinase Activity in Vitro

YANG Yang1, LU Jun2, SUN Bing-jie1, WANGDan1,YIN Xiao-yan1, REN Di-feng＊1

(1.College of Biological Sciences and Bio technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

The inhibitory effect of resveratrol on the activity of monophenolase and diphenolase existing in tyrosinase was investigated by the enzymatic kinetic method at 30℃in a Na2HPO4-NaH2PO4buffer system(p H6.8).The results indicated that resveratrol could inhibit both the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase,and the IC50values (resveratrol concentration corresponding to 50%inhibitory rate)w ere 5.1 mg/m L and 5.6 mg/m L,respectively.Furthermore,resveratrol could extent the lag time of monophenolase for oxidation of L-tyrosine,of which 8 mg/m L of resveratrol prolonged the lag time from 22 s to 62 s,while no such effect was observed on diphenolase.According to the Lineweaver-Burk plot,resveratrol was found to be a mixed inhibitor for the oxidation of L-DOPA,and the equilibrium constants for binding with free enzyme KIand with enzyme-substrate comp lex KISwere 3.4 mg/m L and 35.98 mg/m L,respectively.

resveratrol,tyrosinase,inhibitory activity,enzymatic kinetics

＊

任迪峰(1973-),女,湖南岳陽(yáng)人,工學(xué)博士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)與營(yíng)養(yǎng)研究。Email:rendifeng@163.com

Q 55

A

1673-1689(2011)04-0632-04

2010-09-01

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(TD2010-3、BL YX200935)、第38批留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金。