HPLC示差折光法測定水產(chǎn)品中還原糖、磷酸化單糖和蔗糖

張進杰, 顧偉鋼, 閆永芳, 姚燕佳, 陳健初, 葉興乾

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310029)

HPLC示差折光法測定水產(chǎn)品中還原糖、磷酸化單糖和蔗糖

張進杰, 顧偉鋼, 閆永芳, 姚燕佳, 陳健初, 葉興乾＊

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310029)

以市售淡水魚為試材,建立水產(chǎn)品中還原糖(葡萄糖、核糖)、磷酸化糖(磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖)和蔗糖的定性、定量檢測方法。對魚肉中各糖進行檢測,建立魚肉中糖的高效液相示差折光分析法檢測法。將魚肉分成背部肌肉和腹部肌肉兩個部分,用乙醇/水提取魚肉中各糖物質(zhì),經(jīng)樹脂吸附處理后,對魚肉中各糖物質(zhì)進行分析。磷酸化糖檢測,首先用堿性磷酸酶脫磷酸化,然后用同法進行檢測。結(jié)果顯示:各糖物質(zhì)分離效果較好,方法學(xué)驗證,各物質(zhì)線性關(guān)系良好,回收率在70.2%～98.5%之間,重復(fù)性RSD均小于5%。

水產(chǎn)品;還原糖;磷酸化糖;堿性磷酸酶;HPLC-RI

在高蛋白食品(水產(chǎn)品和肉制品等)中所含的羰基化合物(尤其是還原糖)能和氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)[1]。新鮮豬肉中加入少許核糖,烹飪后豬肉特有的烤肉味明顯加強[2]。也有報道在肉制品制作過程中添加5’-磷酸核糖,6’-磷酸葡萄糖或葡萄糖能促進肉制品特有的風(fēng)味[3]。因此對高蛋白質(zhì)食品中糖的研究具有重大意義。在一些肉制品和植物發(fā)酵液中某些游離糖和二聚糖的含量已有報道[4-6]。但對魚制品中的還原糖,磷酸化糖和蔗糖含量的研究還少有詳細報道。

用氣相色譜法可以檢測牛肉的水相提取物中游離糖(葡萄糖,果糖和核糖)和磷酸化糖(6’-磷酸葡萄糖,6’-磷酸果糖,1,6’-2磷酸果糖)含量,但需通過復(fù)雜的衍生化前處理操作步驟[5]。也有報道利用離子交換色譜柱,電流脈沖檢測器,耐堿HPLC系統(tǒng)可同時檢測還原糖及它們的磷酸化物質(zhì)[7],此法具有高效率和高靈敏度,但儀器成本太高,一般實驗室不具備如此高端的條件。

作者以HPLC示差折光法同時測定淡水魚肉中核糖、葡萄糖、果糖和蔗糖,檢測磷酸化糖含量時采用堿性磷酸酶對磷酸化糖進行脫磷酸化處理后進行檢測,然后采用差量法算得磷酸化糖含量。此法同樣適用于其他食品,如臘魚、魚丸、土豆還有蓮藕中糖物質(zhì)含量的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

10種淡水魚(青魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚、鱖魚、團頭鳊、鯰魚、烏鱧)于2010年3～5月間分批購自杭州市農(nóng)貿(mào)市場,選體態(tài)均一的成年活魚。分別取魚背部肌肉和腹部肌肉,去皮和可見脂肪和紅肉后備用;臘魚(L Y1),臘魚(LY2),魚丸1,魚丸2:購自杭州物美超市;添加蔗糖腌制臘魚(L T)和未加糖腌制臘魚(LN):作者所在實驗室自制于2010年2月份,-80℃條件貯存。

主要試劑:氯仿:分析純,上海生工產(chǎn)品;HPLC級乙醇和乙腈:美國 Tedia公司產(chǎn)品;純水,HPLC級:娃哈哈公司產(chǎn)品;所有還原糖和磷酸化糖(5’-磷酸D核糖二鈉,6’-磷酸 D-葡萄糖二鈉水合物,α-D-乳糖1水化合物,D-核糖,D-果糖,D-葡萄糖,1,6’-2磷酸D-果糖鈉鹽,6’-磷酸D-果糖二鈉,蔗糖:均購自 Sigma公司產(chǎn)品;堿性磷酸化酶(EC 3.1.3.1,取自小牛的腸粘膜):購自 Sigma公司;樹脂Dowex 50WX4(強酸性陽離子交換樹脂,20-400目)和 Anino WGR-2(弱陰離子交換樹脂,20-40目);注射器濾膜(0504-017K,直徑 13 mm,孔徑0.2μm:購自上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 魚肉中糖的提取

魚肉中提取糖的試驗過程參考Jones和A liani[8,9]的方法,稍加修改。取100 g左右魚肉(背脊肌肉或腹部肌肉)用絞肉機攪碎。取碎魚肉(3 g)置于50 m L離心管中。加入0.5 mL 40 mmol/L的α-D乳糖作為內(nèi)標。添加10 m L無水乙醇均質(zhì)3 min。然后800g離心5 min。再用體積分數(shù)80%乙醇重復(fù)提取3次。約40 m L的上清液,再添加150 m L氯仿混勻脫脂,靜置40 min后分液。取1.5 m L提取液進行酶解,用于分析磷酸化糖。

取6 m L提取液和3 g樹脂混合物(Dow ex 50WX4和Anion WGR-2質(zhì)量比1∶1)除去干擾物,比如鹽和氨基酸?；旌蠞嵋涸?00g離心30 min除去樹脂,上清液用于HPLC分析(4℃條件下可儲存24 h)。

1.3 酶解處理

堿性磷酸酶(0.55 units m L-1),在甘氨酸緩沖液(50 mmol/L,含 0.5 mmol/L 的 M gCl2,用0.1mol/L的 NaOH調(diào)p H至 9.3)中配制。3.5 m L酶液和1.5 m L魚肉提取物混合,39℃水浴90 min。自然冷卻后,用 Acrodisc 13LC濾膜過濾除酶,然后同上步還原糖提取處理加入3 g樹脂混合物,進行還原糖提取。磷酸葡萄糖和磷酸核糖含量通過酶處理和非酶處理之差計算得。

1.4 色譜條件確立

1.4.1 色譜條件 HPLC分離條件參考田燕鈴[10]的方法,Waters e2695系列高效液相色譜儀、Enpow er 2工作站、Waters 2414示差折光監(jiān)測器、Hypersil NH2柱(250 mm ×4.6 mm,5μm);以乙腈和水的混合液為流動相,通過調(diào)節(jié)乙腈/水(V/V)的比例,柱溫,檢測池溫度和流速來達到各峰分離的目的。

1.4.2 定性 將4種糖分別配成V(乙腈)∶V(水)=80∶20溶液,并在已確定的色譜條件下測定,確定標準物質(zhì)的保留時間,再將各糖分別混合,用保留時間結(jié)合峰增高法定性。

1.5 驗證

1.5.1 線性關(guān)系的考察 稱取1 mg核糖、葡萄糖、果糖、蔗糖,定容于10 m L容量瓶中。假定每個標樣的質(zhì)量濃度為100 mg/L,稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度。在已確定的色譜條件下,進樣10μL,進行HPLC分析。在測定過程中根據(jù)需要調(diào)整濃度。根據(jù)液相色譜中的峰面積與標準樣品中標準物質(zhì)的絕對進樣量進行線性回歸,確定回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.5.2 回收率、重復(fù)性和最低檢測限的考察 將一定量的各糖標準品加到3 g碎肉樣品中,按照1.2節(jié)方法進行前處理,在已確定的色譜條件下進行HPLC測定,同時檢測未加糖標樣的同種魚肉樣品。計算各組分的加標回收率。重復(fù)性為此回收率檢測試驗的6個平行處理。

取最低質(zhì)量濃度的標準品混合液,用流動相進行倍比稀釋(2、3、4、6、8、12、16 和 24 倍)。取 10 L進樣。以信噪比S/N=3為標準,測試該色譜條件下的最低檢測量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)分析。各樣品測定結(jié)果以均值±標準差(means±SD)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

在前人研究[9,10]的基礎(chǔ)上采用氨基柱為固定相,選擇乙腈與水的混合液作為流動相,通過優(yōu)化分離條件,達到較優(yōu)的 HPLC-RI分離各糖的條件。作者曾考察不同乙腈-水體積比(75∶25、78∶22、80∶20和 82∶18),不同流量(0.5,0.6,0.7和 0.8 m L/min)不同柱溫(20、25、30和35 ℃)和不同檢測池溫度(30、35,40和45℃等)對分離結(jié)果的影響。結(jié)果表明乙腈-水(兩者體積比80∶20),流量0.6 m L/min,柱溫為25℃,檢測池溫度35℃條件下,核糖、蔗糖和α-乳糖分離度好,峰形銳、出峰時間適宜;葡萄糖和果糖具有相似的分子結(jié)構(gòu),保留時間較接近,經(jīng)實驗驗證不影響其定性和定量計算。5種單糖的色譜圖見圖1(a)。

圖1 典型樣品各糖含量色譜圖Fig.1 Typical examples of HPLC chromatograms,obtained as described and plotted to different scales

2.2 定性分析

通過峰增高法并參照保留時間進行定性分析,確定保留時間為 8.418、10.275、10.979、14.800、18.150 min的物質(zhì)分別為∶核糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、α-乳糖。

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

以峰面積為橫坐標,標準物質(zhì)的絕對進樣量為縱坐標進行回歸,計算得各單糖標準曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(見表1)。由表1的數(shù)據(jù)表明,各物質(zhì)峰面積與絕對進樣量之間呈良好的線性關(guān)系。

核糖,葡萄糖,蔗糖,果糖,磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖的平均回收率分別為96.2、97.2、98.4、98.5、91.2和70.7%。表2為6個平行重復(fù)檢測結(jié)果,以標準偏差來衡量重復(fù)性。變異系數(shù)范圍在0.6%～3.8%之間。均優(yōu)于A liani等[9]所得試驗結(jié)果,此差別可能是其采用柱后衍生和UV紫外檢測器與本實驗檢測系統(tǒng)不同有關(guān)。Wight和van Niekerk[11]以蜂蜜為研究對象,采用熱水提取法提取蜂蜜中的單糖,柱后衍生法檢測果糖和葡萄糖,得到的回收率分別為99.1%和98.1%,與作者實驗結(jié)果接近。

在本 HPLC方法中核糖、葡萄糖、果糖和蔗糖的最低檢測限分別為85,125,125和150 ng,轉(zhuǎn)化成濃度分別為8.5μg/m L,12.5μg/m L和15μg/m L,比A liani等[9]的報道,核糖,葡萄糖和果糖的最低檢測限0.62,0.72和0.71 m g/m L要低。卻比Wight和van Niekerk[11]報道的葡萄糖,果糖和乳糖的檢測限11,6,55 ng要高出許多。這主要是本試驗采用的是示差折光檢測器。RID相對于UV、FD和ELSD的靈敏度偏低。但此檢測限足以滿足本試驗的需求,而且本操作簡便、效率高、檢測系統(tǒng)價格適中。

表2 魚肉提取物中各種單糖的回收率和最低檢測限Tab.2 Recovery from fish and detection lim it in aqueous solution

2.4 提取方法優(yōu)化

乙醇/水混合物作萃取劑能起到沉淀蛋白,同時使魚肉組織中的酶鈍化,所以通常用來提取單糖和二糖。通過預(yù)試驗得出V(乙醇)∶V(水)=80∶20是提取單糖的最佳比例。單糖也可以用水提[11],但水提法會導(dǎo)致提取液中含有原料魚肉中的酶類,導(dǎo)致后步堿性磷酸酶脫磷酸化反應(yīng)受到干擾,故本試驗采用V(乙醇)∶V(水)=80∶20提取樣品中的糖。

由圖1(b)可知魚肉的乙醇/水混合物提取液中的物質(zhì)非常復(fù)雜。為避免氨基酸、核苷酸等物質(zhì)干擾,在本實驗中乙醇/水混合提取液用陽離子樹脂和陰離子樹脂進行吸附純化,除去磷酸化糖、氨基酸和鹽類等雜質(zhì),然后再進行糖含量檢測。

在檢測磷酸化糖含量時,首先對乙醇/水的提取液進行堿性磷酸化酶酶解,再采用樹脂進行除雜。

2.5 堿性磷酸酶水解反應(yīng)

堿性磷酸酶對磷酸化糖的酶解沒有特異性,能夠水解磷酸化糖成其相應(yīng)的前體還原糖。所以在魚肉的糖提取液中添加堿性磷酸酶對磷酸化葡萄糖和磷酸化核糖進行脫磷酸化處理,生成相應(yīng)的還原糖(葡萄糖和核糖),通過檢測,計算出酶解前后相應(yīng)還原糖含量之差,得出魚肉中磷酸化葡萄糖和磷酸化核糖的含量。

在p H值分別為8.3,9.3和10.3的條件下檢測堿性磷酸酶的活性,得出在p H值為9.3的條件下堿性磷酸酶水解5’-磷酸核糖和6’-磷酸葡萄糖的活性最強。在5’-磷酸核糖和6’-磷酸葡萄糖得混合溶液中將1.3 mg/mL的5’-磷酸核糖完全水解的酶液最低濃度是2.7 u/m L,將1.2 mg/mL的6’-磷酸葡萄糖完全水解的最低酶液濃度為9.6 u/mL。39℃條件下5’-磷酸核糖完全轉(zhuǎn)化的水浴加熱時間為60 min,而6’-磷酸葡萄糖完全轉(zhuǎn)化需要90 min。在本實驗過程中為確保5’-磷酸核糖和6’-磷酸葡萄糖能完全酶解,酶解條件確定為:堿性磷酸酶濃度選擇9.625 u/m L,39℃水浴加熱90 min。

還發(fā)現(xiàn)在磷酸化核糖與磷酸化葡萄糖糖標準品的混合液中,經(jīng)酶解,5’-磷酸核糖可以100%的轉(zhuǎn)化成核糖,6’-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的轉(zhuǎn)化率在80%～85%之間。6’-磷酸葡萄糖的較低轉(zhuǎn)化率,在某種程度上解釋了表2中6’-磷酸葡萄糖的低回收率。延長水浴時間和增加酶量不能提高6’-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率,也不能提高6’-磷酸葡萄糖的回收率。有報道[8],在水溶液的環(huán)境中堿性磷酸酶水解 6’-磷酸果糖的轉(zhuǎn)化率為97%,1,6’-2磷酸果糖的轉(zhuǎn)化率為68%,當(dāng)為這兩種糖的混合溶液時,它們的總轉(zhuǎn)化率只有70%;證實堿性磷酸酶不僅能夠?qū)?’-磷酸葡萄糖部分轉(zhuǎn)化為葡萄糖,而且能將 6’-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成果糖(5%左右的轉(zhuǎn)化率)。在本實驗條件下(p H 9.3,39℃),在葡萄糖溶液中添加堿性磷酸酶,經(jīng)檢測葡萄糖有100%的回收率,沒有出現(xiàn)果糖雜峰,所以6’-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖,可能是所用的磷酸化酶不純的緣故造成。如圖1(c,d)所示,本試驗所用的磷酸化酶沒有將磷酸化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的現(xiàn)象發(fā)生。

選擇了一種與被分析的還原糖無干擾且在魚肉中不存在的還原糖作為內(nèi)標。首先棉籽糖被選擇內(nèi)標,但是棉籽糖在堿性磷酸酶存在的條件下容易發(fā)生部分分解反應(yīng);魚肉中不含α-D-乳糖,且α-D-乳糖不被堿性磷酸化酶分解,所以將α-D-乳糖選作內(nèi)標。

2.6 鮮魚肉中還原糖和磷酸化糖含量的檢測

糖溶液的典型色譜圖如圖1(a)所示。核糖、葡萄糖、果糖和蔗糖相對于乳糖保留時間短,先被檢測到。圖1(b)是魚肉中糖提取液未經(jīng)樹脂吸附處理,直接檢測的色譜圖,由圖得出,魚肉的直接乙醇/水提取液中干擾物質(zhì)非常多。圖1(c)是魚肉中糖未經(jīng)磷酸化酶酶解的色譜圖,圖1(d)是相同魚肉經(jīng)酶解后的色譜圖。圖1(c)和圖1(d)的色譜峰高度之間的差異是酶解處理的提取過程導(dǎo)致提取液濃度差異所致。

由圖1(c)和圖1(d)可以看出新鮮魚肉中不含蔗糖。圖2是10種市售新鮮魚樣的背部肌肉和腹部肌肉的還原糖(核糖和葡萄糖)和磷酸化糖(磷酸核糖和磷酸葡萄糖)的6次質(zhì)量分數(shù)檢測結(jié)果的平均值和標準偏差。由圖可知不同魚種間各糖質(zhì)量分數(shù)均不相同,同種魚部位不同各糖質(zhì)量分數(shù)也均不相同。鯽魚和鱖魚腹部肌肉中糖總質(zhì)量分數(shù)最高,分別為260.2 mg/hg和262.1 mg/hg。鰱魚和鳙魚背部肌肉中總糖質(zhì)量分數(shù)最低,分別為48.7 m g/hg和49.1 mg/hg。青魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯉魚、鱖魚和團頭鳊魚魚背部肌肉糖含量均比腹肌肉低,而鯰魚和烏鱧的背部肌肉糖含量卻高于腹部肌肉。魚肉組織中各糖含量少有報道,Jones[8]用HPLC方法從魚組織中分離出磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖,但沒有對核糖和葡萄糖進行分析,也未對磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖含量作具體報道。

圖2 10 種淡水魚(A:草魚;B:青魚;C:鰱魚;D:鳙魚;E:鯽魚;F:鯉魚;G:鱖魚;H:團頭鳊;I:鯰魚;J:烏鱧)背部肌肉和腹部肌肉中還原糖和磷酸化糖的質(zhì)量分數(shù)(均以100 g樣品濕基計算)(n=6)Fig.2 Concentrations(mg 100g-1 wet weight)of reducing and phosphorylated sugars in dorsal and belly of 10 kinds of fish(A:Ctenopharyngodon idellus;B:piceus;C:Hypophthalmichthys molitrix;D:Aristichthys mobilis;E:Carassius auratus;F:Cyprinus carpio;G:Chinese perch;H:Megalobrama amblycephala;I:Oriental sheatfish;J:Ophicephalus argus)(n=6)

2.7 其他食品中糖物質(zhì)含量檢測

用本方法檢測臘魚和魚丸等魚肉制品中糖含量。如圖1(e)和表3所示。腌制臘魚和市售魚丸中均檢測出核糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖6種糖。自制加糖(蔗糖)腌制的臘魚中蔗糖質(zhì)量分數(shù)為620.0 mg/hg,未添加蔗糖腌制的臘魚中未檢測出蔗糖,說明市售臘魚在腌制過程中均添加了蔗糖。在不含蔗糖的臘魚樣品中未檢測出核糖,而含蔗糖量高的自制加糖臘魚(L T)樣品中核糖含量最高(6.5 mg/hg)。鮮魚中未檢測到果糖,被檢測魚丸中不含果糖或低含量果糖(2.5 mg/hg),而腌制臘魚中含有果糖,且含量非常高(17.6-50.7 mg/hg),這可能與臘魚長期受微生物的作用和魚肉中本身的內(nèi)源酶類作用有關(guān),具體原因還有待研究。

本方法同樣應(yīng)用于植物性食品中糖含量的檢測,如圖1(f),蓮藕中含葡萄糖和蔗糖,其中蔗糖含量高達1 353.7 mg/hg。如表3所示土豆中含葡萄糖(920.2 mg/hg)、果糖(373.2 mg/hg)含量比 Aliani等[9]報道的0.5-1.5 g/hg稍低,但是他未報道土豆中含有蔗糖,但本實驗檢測到土豆中含蔗糖(27.2 g/hg),這可能和檢測方法和土豆品種不同有關(guān)。

表3 食品中糖質(zhì)量分數(shù)的檢測結(jié)果Tab.3 Concentrations(mg/100g wet weight)of sugars and phosphorylated sugars in some foods

3 結(jié) 語

采用 HPLC-IR技術(shù)建立核糖、葡萄糖、果糖、蔗糖的線性回歸方程,相關(guān)系數(shù)均為0.999,質(zhì)量濃度線性范圍20～200 mg/L,核糖、葡萄糖、果糖、蔗糖的最低檢測限分別為85,125,125和150 ng。用氨基柱測定魚肉中各糖含量的前提需用離子交換樹脂對其進行脫氨基酸和鹽等純化處理。磷酸化單糖檢測,首先用堿性磷酸酶脫磷酸化,檢測酶解前后樣品中各還原糖含量之差得出各磷酸化單糖質(zhì)量分數(shù)。用堿性磷酸化酶酶解魚肉中的磷酸化單糖的最優(yōu)條件是:堿性磷酸酶濃度選擇9.625 u/m L,39℃下水浴90 min。此方法可應(yīng)用于新鮮淡水魚肉及魚肉制品等食品中糖物質(zhì)的定性、定量分析,樣品無需衍生化,方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。

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Determination of Reducing Sugars,Phosphorylated Sugars and Sucrose in Fish Products by HPLC-RI

ZHANG Jin-jie, GU Wei-gang, YAN Yong-fang, YAO Yan-jia,CHEN Jian-chu, YE Xing-qian＊

(College of Biosystem Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China)

The freshwater fish were selected as materials,and a HPLC-RI method for detecting reducing sugars,phosphorylated reducing sugars and sucrose from fish meat and other foods was established in this study.The chromatographic conditions of reducing sugars were investigated and optimized.A Hypersil N H2(4.6 250 mm,2.5μm)column was used,the mobile phases were 80%ethanol and 20%purified water at the flow rate of 0.6 m L/min,the column temperature was 25 ℃,and the differential refractive index detector temperature was 40 ℃.Ethanol/water(80%v/v)was used to extract mono-and disaccharides from dorsal and belly of fish,and adding resin to remove the amino acids and salts from the extract.The sugars in fish dorsal and belly were determined by the established HPLC-RI method.Phosphorylated sugars were first dephosphorylated by alkaline phosphatase and then determined by the same method.The result showed that the method had a good resolution and good linearity,the recovery rate was between 70.2%and 98.5%,and the RSD of repeatability were all lower than 5%.Theresult of detection showed that there were differences in category and content of sugars between different parts of fish.

fish product,reducing sugars,phosphorylated suagers,sucrose,HPLC-RI

TS 2

A

1673-1689(2011)04-0576-07

2010-10-09

國家“十一五”科技支撐計劃項目 (2009BAD9B05);浙江省科技計劃項目(2008C02015);浙江省重大科技專項(2010C12012)。

＊

葉興乾(1962-),男,浙江寧波人,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工和食品快速分析研究。Email:psu@zju.edu.cn