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    禽流感實用診斷技術(shù)

    2010-09-17 08:50:18謝青梅畢英佐華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院廣東廣州510642
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2010年4期
    關(guān)鍵詞:尿囊禽流感亞型

    謝青梅,畢英佐(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642)

    禽流感實用診斷技術(shù)

    謝青梅,畢英佐(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642)

    禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的一種禽類病毒性烈性傳染病,OIE把該病定為A類烈性傳染病。許多家禽和野鳥對A型禽流感病毒都有易感性,發(fā)病和危害最大的主要是雞、火雞。鴨、鵝感染H5亞型流感病毒死亡率很高,經(jīng)濟損失很大。雞感染禽流感后可表現(xiàn)出嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降、致死率很高的急性出血性臨床癥狀;也可表現(xiàn)為輕微的呼吸道感染、輕微產(chǎn)蛋率下降,或者是無癥狀隱性帶毒等亞臨床癥狀;致病力尚弱的毒株逐漸變異為高致病性的毒株,危害雞群的健康。所以快速有效的診斷禽流感病毒是及時發(fā)現(xiàn)和及早控制禽流感疫情的關(guān)鍵。

    一、臨床診斷

    (一)基本觀點 禽流感的流行在一定時間內(nèi)已平息下來,但任何免疫失敗均將導(dǎo)致該病的散發(fā)或呈地方性流行。疫苗毒株和流行野毒株之間有一定差異,需要警惕“非典型”H5N1亞型禽流感病毒的存在與發(fā)生。

    高致病性禽流感由H5、H7亞型禽流感病毒引起?;记葜饕憩F(xiàn)為:體溫升高,精神萎頓,毛松,打堆,食欲廢絕,下痢。雞冠發(fā)紺呈暗紅色或蒼白,頭部、面部浮腫,腳鱗出現(xiàn)紫色出血斑。部分病雞出現(xiàn)頭頸和腿部麻痹、抽搐等神經(jīng)癥狀。病程1~2 d,死亡率可達100%。有時沒有明顯癥狀即可見到雞只死亡。種雞僅見產(chǎn)蛋下降、畸形蛋多,多由“點”暴發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)槿罕┌l(fā)。鴨、鵝等水禽可見神經(jīng)和腹瀉癥狀,可見眼角膜炎、甚至失明等癥狀。剖檢可見腸道、盲腸扁桃體、胰腺輕微出血,甚至出現(xiàn)喉頭氣管有粘液的“非典型”病變,種雞卵泡變性與壞死、輸卵管炎等。

    (二)指示性臨床診斷指標(biāo)

    1.未免疫禽群。突發(fā)、急劇的倍數(shù)增長的死亡;萎頓、雞冠發(fā)紺的雞只很快死亡;早期病死雞以全身性出血性變化為主。未免疫雞群出現(xiàn)HI抗體陽性就可確診。

    2.免疫禽群。雞群中出現(xiàn)萎頓,雞冠發(fā)紺,趾部角質(zhì)變紅趨向的雞只很快死亡,并延續(xù)數(shù)天,可見腫頭及流淚。病死雞肝臟變化為主,呈現(xiàn)偏淡的多色彩、質(zhì)脆,胰腺、腺胃乳頭出血常見。檢查HI抗體可見群體抗體水平參差不齊,出現(xiàn)一定數(shù)量HI抗體滴度≥12log2的樣本。

    3.未免疫鴨。沉郁、明顯的神經(jīng)癥狀,頭頸扭曲、抽搐、癱瘓,臨床癥狀出現(xiàn)后死亡急速上升,死亡率30%~100%。種鴨初期采食下降,產(chǎn)蛋下降可達10%~90%。

    4.免疫鴨。商品鴨發(fā)病日期在20日齡以后,神經(jīng)癥狀和死亡明顯。種鴨產(chǎn)蛋下降30%~60%,很少死亡。

    二、鑒別診斷

    H9亞型禽流感非常溫和,經(jīng)常與其他疾病一起并發(fā)感染,癥狀和病變均不明顯。H5亞型禽流感和典型雞新城疫癥狀很相似,可根據(jù)以下要點進行鑒別診斷(見表1)。

    三、禽流感病毒鑒別診斷技術(shù)

    目前,禽流感的鑒別診斷技術(shù)很多,常用技術(shù)主要有病毒分離鑒定、病毒血清中和試驗和RT-PCR技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、RTLAMP技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)。病毒分離鑒定是傳統(tǒng)可靠的方法,但必須在國家許可的P3實驗室進行。在眾多的分子生物學(xué)技術(shù)中最常用的技術(shù)還是RT-PCR技術(shù),不需要分離病毒,具有快速、簡便的優(yōu)點;RT-LAMP技術(shù)是一新型的分子生物學(xué)技術(shù),不需要分離病毒,不需要昂貴的PCR儀和電泳系統(tǒng),加入染料后檢測結(jié)果肉眼可視,適合于基層簡易實驗室使用;熒光定量PCR技術(shù)也是非常準(zhǔn)確的分子生物學(xué)技術(shù),但他需要昂貴的熒光定量PCR儀器和特殊的試劑等,在口岸的檢驗檢疫中多用。下面詳細(xì)介紹幾種常用禽流感病毒的檢測技術(shù)。

    (一)病毒分離和鑒定采取發(fā)病雞喉拭子、肛拭子或組織器官,加入適量滅菌生理鹽水勻漿,制成10%的懸液,加入雙抗(最終濃度為青霉素1 000 IU/ml、鏈霉素1 000 IU/ml),于 37℃孵育 30 min,然后3 000 r/min離心10~15 min,取上清,再用0.45μm的濾膜過濾除菌,濾液備用。

    將處理后的樣品濾液接種于9~11日齡非免疫雞胚,0.2 m1/胚,37℃孵化,每日照蛋2次,棄去18 h內(nèi)死胚,24~48 h死亡雞胚置4℃冷卻4 h或過夜。無菌收獲尿囊液,測定尿囊液對1%雞紅細(xì)胞的血凝活性并觀察雞胚病變。有血凝活性者作進一步鑒定;無血凝活性者將其尿囊液和羊水盲傳兩代,仍無血凝活性者棄去。取無菌澄清的尿囊液用于病毒血清型鑒定。采用血凝抑制(HI)試驗方法用H5、H9亞型禽流感和新城疫(ND)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進行測定。

    (二)RT-PCR鑒別診斷技術(shù)RT-PCR方法是鑒別診斷禽流感病毒的非常簡便、快速的方法。分別用H5亞型禽流感病毒(H5 AIV)、H9亞型禽流感病毒(H9 AIV)和新城疫病毒(NDV)特異性引物進行RT-PCR鑒別診斷,根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶大小判定結(jié)果。在鑒別診斷疑似病例時,此RT-PCR方法顯示了較大的優(yōu)越性,在臨床診斷上快速鑒別診斷H5、H9亞型AIV和NDV的感染具有重要的實踐意義。

    具體操作如下:取病料或喉拭子,加入適量滅菌生理鹽水勻漿,離心取上清,用RNAout試劑盒(按說明書進行)提取總RNA。然后用H5 AIV、H9 AIV和ND對應(yīng)的引物用RT-PCR一步法試劑盒進行擴增,PCR產(chǎn)物用1%的凝膠電泳進行檢測。若電泳條帶大小為545 bp,就可以初步判定結(jié)果為H5亞型AIV;若電泳條帶大小為488 bp,就可以初步判定結(jié)果為H9亞型AIV;若電泳條帶大小為672 bp,就可以初步判定結(jié)果為NDV。為了進一步確診,需要送PCR擴增產(chǎn)物到生物工程公司進行序列測定,根據(jù)序列分析確診結(jié)果。鑒別診斷的經(jīng)典引物序列如下:

    1.H5 AIV上游引物(H5UP):5,-ACACATGCYCARGACATA CT-3’,下游引物(H5DN):5,-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3,,擴增產(chǎn)物大小為545bp。

    表1 H5亞型禽流感和典型雞新城疫的鑒別診斷

    2.H9 AIV上游引物(H9UP):5,-CTYCACACAGARCACAAT GG-3,,下游引物(H9DN):5,-G TCACACTTGTTGTTGTRTC-3,,擴增產(chǎn)物大小為488bp。

    3.DNV上 游 引 物(NDUP):5,-TCATACCCAGATTATATCG-3,;下游引物(NDDN):5,-TGGT AATCTTGTTCATC-3,,擴增產(chǎn)物大小為672bp。

    (三)實時熒光定量RT-PCR技術(shù)熒光RT-PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的新技術(shù),將熒光素標(biāo)記的探針與引物一起,在熒光PCR儀中反應(yīng),電腦對整個反應(yīng)進行實時監(jiān)測,避免了交叉污染,提高了檢測敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原體、艾滋病病毒等的檢測,熒光RT-PCR方法對PCR產(chǎn)物可以實時監(jiān)控,省卻了電泳和EB染色;由于采用特異性熒光探針和高靈敏度熒光PCR儀,比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100~1 000倍。在檢驗檢疫實踐工作中常用。深圳出入境檢驗檢疫局與深圳太太基因工程有限公司聯(lián)合研制了同時檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的實時熒光多重RT-PCR檢測試劑盒,廣泛用于口岸的檢驗檢疫中。

    (四)RT-LAMP診斷技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是一種新穎的恒溫核酸擴增方法。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域,設(shè)計4種特異引物(2條外引物和2條內(nèi)引物),利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫(65℃左右)中反應(yīng)1 h,即可完成核酸擴增反應(yīng),反應(yīng)結(jié)果可根據(jù)擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判斷;也可以在終產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料,直接用肉眼觀察結(jié)果,而不需模板熱變性、長時間的溫度循環(huán)、凝膠電泳、紫外觀察等過程。國外有報道用RT-LAMP技術(shù)檢測人流感H1、H2和H3亞型流感病毒,還用于鑒定流感A、B型的診斷。H5亞型禽流感病毒RT-LAMP技術(shù)是一種檢測H5亞型禽流感病毒的有效快速的可靠方法,對生產(chǎn)實踐具有實踐指導(dǎo)意義。

    H5亞型禽流感病毒的RTLAMP方法具體操作為:從組織勻漿或尿囊液中提取AIV總RNA 作 為 模 板。 在 25 μl反 應(yīng)體系中分別加入以下組分:10×buffer 2.5 μl,dNTPs(2.5 mmol/L)4 μl,FIP/BIP(10 μmol/L)2 μl,引 物 F3/B3(10μmol/L)0.5 μl,Bst DNA polymer-ase 1μl(8U/μl),AMV反 轉(zhuǎn) 錄 酶1μL(100U/μl),RNA 5 μl,DEPC 水 6.5 μl。混勻后,42℃保溫10 min,之后在65℃擴增60 min,最后80℃反應(yīng)10 min終止反應(yīng),擴增產(chǎn)物可以用0.02 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L的溴化乙錠)電泳檢測,電泳條件為80 V、30 min,用VL凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果;或者在擴增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料,陽性結(jié)果會呈現(xiàn)綠色,不需用瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)典的檢測H5亞型禽流感病毒的LAMP引物如下:

    外引物F3: 5,-GCCATTCCA CAACATACACCC-3,;

    內(nèi)引物FIP:5,-CTGAGTCCA GTCGCAAGGACTAATCTGTTTT-TCTCACCATCGGGGGAA TGCC-3,;

    內(nèi)引物BIP: 5,-GGATGGCA GGGAATGGTAGAT-GG-TTTTGTATCCACTCCCCTGCTCATTG C-3,;

    外引物B3: 5,-TGGTGACTC CATCTATTGCCT-3,。

    (五)其他技術(shù)禽流感病毒檢測技術(shù)還有膠體金試紙條技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)、基因芯片技術(shù)、TEMPCR技術(shù)等檢測技術(shù),這些技術(shù)目前看來還是不太適合于普通實驗室使用。禽流感監(jiān)測和診斷技術(shù)的研究在不斷的深入和拓寬,這對防控禽流感有非常重要的意義。

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