燙傷寧的無菌檢查方法驗(yàn)證

黃 蓓

（廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

2005年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，在進(jìn)行藥品無菌檢查時(shí)應(yīng)驗(yàn)證所用方法，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查[1]。燙傷寧是由地榆、虎杖、紅花、陳皮、當(dāng)歸、冰片等組成的中藥復(fù)方制劑，以食用植物油為基質(zhì)，具有抗菌、消炎作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等多種細(xì)菌均有抑制作用，主治燙傷、燒傷。根據(jù)藥典要求，對(duì)該藥應(yīng)進(jìn)行無菌檢查，但因其具有抗菌作用，不能用直接接種法，且本制劑為油劑，不易大量過濾。為此，筆者參照2005年版《中國(guó)藥典（一部）》微生物限度檢查項(xiàng)下非水溶性供試品的離心沉淀集菌法[1]，采用離心與薄膜過濾相結(jié)合的方法對(duì)燙傷寧進(jìn)行無菌檢查，并對(duì)所用方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料

HTY-Ⅲ型智能集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；全封閉無菌試驗(yàn)過濾培養(yǎng)器（杭州高得醫(yī)療器械有限公司）。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)為080616）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)為071018）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)為071013）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為080321），均由廣西藥品檢驗(yàn)所提供；稀釋液為0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自配）。金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由廣西藥品檢驗(yàn)所提供。供試品燙傷寧（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 無菌檢查方法驗(yàn)證[2-3]

2.1.1 菌液制備

取30～35℃下培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL，加到9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋成含菌數(shù)小于100 CFU/mL的菌懸液；取23～28℃下培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，加到9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋成含菌數(shù)小于100 CFU/mL的菌懸液；取30～35℃下培養(yǎng)18～24 h的生孢梭菌的硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物1 mL，加到9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋成含菌數(shù)小于100 CFU/mL的菌懸液；取23～28℃下培養(yǎng)1周的黑曲霉菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加0.9%氯化鈉溶液3 mL，洗下孢子，轉(zhuǎn)移至另一空管，用0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋成含孢子數(shù)小于100 CFU/mL的菌懸液。

2.1.2 活菌計(jì)數(shù)

活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

表1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果（CFU/mL）

2.1.3 取樣與前處理方法驗(yàn)證

取6瓶燙傷寧，每瓶各加入1種菌懸液2 mL后，分別轉(zhuǎn)移至6個(gè)100 mL無菌刻度離心管中，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理20 min，分離上清液，每管留底部液體2 mL。每管取上清液及底部液體各2 mL，分別等量注入2個(gè)平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)菌離心收集率。細(xì)菌離心收集率（%）=底部液體細(xì)菌培養(yǎng)每平皿平均菌落數(shù)/1 mL菌懸液平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果由表2可見，離心集菌方法有效、可行。

表2 上清液及底部液體細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

2.1.4 取樣量與前處理

參照2005年版《中國(guó)藥典（一部）》中無菌檢查的有關(guān)規(guī)定，做驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，每一驗(yàn)證菌株需要的樣品量相當(dāng)于每一濾筒的樣品量，即包裝規(guī)格為100 mL的燙傷寧每一驗(yàn)證菌株需要3瓶。取燙傷寧3瓶，分別轉(zhuǎn)移至6個(gè)50 mL無菌刻度離心管中，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理20 min，棄去上清液，每管留底部液體2 mL，每管加2 mL已滅菌的聚山梨酯-80，振搖使混勻[1]，然后將混合液體匯集至450 mL的0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，45℃水浴中適當(dāng)加熱，振搖得供試液。

2.1.5 方法驗(yàn)證試驗(yàn)

取KSF 220型全封閉無菌試驗(yàn)過濾培養(yǎng)器（兩聯(lián)）1套，將2.1.3項(xiàng)下供試品趁熱按薄膜過濾法過濾至一管，過濾完畢后用0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液[4]100 mL沖洗濾器；并在沖洗液中加入小于100 CFU的試驗(yàn)菌，再泵入相應(yīng)的培養(yǎng)基作為供試品管；另一管不過濾供試品（其他操作同上），作為陽性對(duì)照管；取全封閉無菌試驗(yàn)過濾培養(yǎng)器，每個(gè)濾器內(nèi)過濾2 mL已滅菌的聚山梨酯-80和0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，再取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基，分別泵入兩管集菌器中，作為陰性對(duì)照管；最后取試驗(yàn)用的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基作為空白對(duì)照管。將上述集菌器培養(yǎng)5 d，每天觀察并記錄結(jié)果（表3）。結(jié)果表明，供試品管與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌對(duì)照管相比24 h內(nèi)生長(zhǎng)良好，與白色念珠菌、黑曲霉菌對(duì)照管相比48 h內(nèi)生長(zhǎng)良好，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基陰性對(duì)照管、改良馬丁培養(yǎng)基陰性對(duì)照管及空白對(duì)照管5 d內(nèi)無菌生長(zhǎng)，說明樣品經(jīng)上述處理后無抑菌作用，所用的聚山梨酯-80與0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)無影響，此無菌檢查方法可行。

表3 方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.2 燙傷寧無菌檢查法

取燙傷寧9瓶，每瓶轉(zhuǎn)移到2個(gè)50 mL無菌刻度離心管中，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理20 min，棄去上清液，每管留底部液體2 mL，每管加2 mL已滅菌的聚山梨酯-80，充分振搖后分別匯集至450 mL的0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，45℃水浴加熱，振搖。將樣品趁熱分別按薄膜過濾法過濾至KSF 330型全封閉無菌試驗(yàn)過濾培養(yǎng)器（三聯(lián)）中，濾后用300 mL的0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾器，沖洗完畢后于兩管泵入硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（其中一管接入小于100 CFU的金黃色葡萄球菌作為陽性對(duì)照管[1]），另一管泵入改良馬丁培養(yǎng)基100 mL。陰性對(duì)照管的制備同2.1.5項(xiàng)下的陰性對(duì)照。上述各管在規(guī)定溫度下培養(yǎng)14 d，逐日觀察。結(jié)果供試品管、陰性對(duì)照管均澄清，陽性管生長(zhǎng)良好，判供試品符合規(guī)定。

3 討論

根據(jù)2005年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅩⅢ無菌檢查法要求，陽性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對(duì)照菌，無抑菌作用及抗細(xì)菌的供試品，可以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌。燙傷寧為抗細(xì)菌制劑，故選擇金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌，且方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果證明，金黃色葡萄球菌管24 h內(nèi)生長(zhǎng)良好，為敏感菌種。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄 71.

[2]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005：313-323.

[3]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2000：18-21.

[4]胡文紅，國(guó) 明.復(fù)方磺胺嘧啶鋅乳膏無菌檢查法的研究[J].中國(guó)藥事，2006，20（3）：154.