劉光斌李懷彪毛和平
(1甘肅省酒鋼醫(yī)院,甘肅 嘉峪關(guān) 735100;2嘉峪關(guān)市藥品檢驗(yàn)所)
高效液相色譜法測(cè)定活血降酶散中的丹參酮ⅡA
劉光斌1李懷彪2毛和平1
(1甘肅省酒鋼醫(yī)院,甘肅 嘉峪關(guān) 735100;2嘉峪關(guān)市藥品檢驗(yàn)所)
【摘要】目的:采用高效液相色譜法測(cè)定組方中主藥丹參所含藥理活性成分丹參酮ⅡA的含量。方法:色譜柱:C18(DaisoSp-120-5-ODS-AP 4.6×250 mm 5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(80∶20);檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm,柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min。結(jié)果:丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在0.026 67~0.213 4 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 9),平均回收率為98.94%,RSD為1.27%。結(jié)論:所用方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、易行,可用于活血降酶散的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】活血降酶散;高效液相色譜法;丹參酮ⅡA
活血降酶散是由丹參、五味子、紅花等中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方,經(jīng)過(guò)多年臨床療效觀察,對(duì)肝炎(包括甲肝、乙肝、丙肝)和黃疸型肝炎瘀血引起的血清轉(zhuǎn)氨酶升高者有非常顯著的降酶作用;同時(shí)能保護(hù)肝細(xì)胞損傷,促進(jìn)肝細(xì)胞再生。為確保該制劑的療效及有效控制制劑質(zhì)量,我們采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)組方中主藥丹參所含藥理活性成分丹參酮ⅡA(C19H18O3)的含量進(jìn)行了測(cè)定,報(bào)告如下。
儀器:BisepTM-1100型高效液相色譜(美國(guó)通微公司);LC-10AD高效液相色譜儀(日本島津公司);U-3900H紫外—可見分光光度計(jì)(HITACHI日立公司);HS2060A超聲波清洗器。
試劑:含量測(cè)定用甲醇為色譜純,水為去離子水,其他試劑均為分析純。
樣品:活血降酶散3個(gè)批次(20090705,20090820,2009 0910)均由酒鋼醫(yī)院提供;丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110766-200314,供含量測(cè)定用)。
2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;色譜柱:C18(DaisoSp-120-5-ODS-AP 4.6×250 mm 5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(80∶20);檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm,柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA(C19H18O3)峰計(jì)算不低于2 000,分離度大于1.5。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
取丹參酮ⅡA照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含10.668 μg的溶液,即得。
2.3 供試品溶液的制備
取同一批次(20090820)樣品粉末0.9 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)
按處方取除丹參外的各味藥材混合粉末0.6 g,按供試品溶液的制備方法,同法制得陰性供試品溶液。依法測(cè)定。結(jié)果陰性供試品在與丹參酮ⅡA對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾,結(jié)果見圖1。
2.5 線性關(guān)系的考察
取丹參酮對(duì)照品溶液(每1mL含10.668 μg),分別精密吸取2.5、5、10、15、20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積均值為縱坐標(biāo),求得回歸方程:Y=6×106X-1 432.4,r=0.999 9。結(jié)果表明丹參酮ⅡA對(duì)照品在0.026 67~0.213 4 μg范圍內(nèi)線性良好。
2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)
精密吸取丹參酮ⅡA對(duì)照品5 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定丹參酮ⅡA峰面積,結(jié)果RSD為0.72%,符合文獻(xiàn)[3]低于1.5%的要求。
2.7 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批次(20090820)樣品粉末6份,每份0.9 g,精密稱定,按供試品溶液的制備方法制備,依法測(cè)定,結(jié)果供試品中丹參酮ⅡA平均含量為0.31 mg/g,RSD為0.32%。表明本方法重復(fù)性較好。
圖1 HPLC色譜圖
2.8 回收率試驗(yàn)
取同一批次(20090820)樣品粉末6份,每份0.90 g,精密稱定,分別精密加入丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液(10.668 μg/ml)25 mL,按供試品溶液的制備方法制備,測(cè)定,結(jié)果平均回收率為98.94%,RSD為1.27%。結(jié)果見表1。
結(jié)果表明,本方法測(cè)定回收率較好。
表1 回收率試驗(yàn)
2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一供試品溶液,分別在0、2、4、6、8、10小時(shí)進(jìn)樣,測(cè)得峰面積值的RSD為0.59%,結(jié)果見表2。
結(jié)果表明供試品溶液在10小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。
表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)
2.10 樣品測(cè)定
按上述方法測(cè)定三批樣品,,三批樣品丹參酮ⅡA含量平均值0.304 3 mg/g。結(jié)果見表3。
表3 樣品測(cè)定
2.11 含量限度的制定
按照表6三批樣品測(cè)定結(jié)果的平均值0.304 3 mg/g,下浮至80%計(jì)算,暫定本品每1 g含丹參按丹參酮ⅡA (C19H18O3)計(jì)算,不得少于0.24 mg。
3.1 波長(zhǎng)的選擇
通過(guò)對(duì)丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液在200~400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測(cè)顯示,丹參酮ⅡA在270 nm處有最大吸收,與文獻(xiàn)[2]采用的波長(zhǎng)相同。
3.2 提取方法的確定與考察
3.2.1 提取方式的確定 取同一批次(20090820)供試品粉末0.9 g,精密稱定,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,稱定重量,分別超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)及與加熱回流30 min,放冷,依法測(cè)定。結(jié)果顯示,采用超聲處理與加熱回流含量結(jié)果基本一致,故采用超聲處理方式提取,以簡(jiǎn)化操作。結(jié)果見表4。
表4 提取方式的考察
3.2.2 提取溶劑的比較取同一批次(20090820)供試品粉末0.9g,精密稱定,置具塞三角瓶中,分別精密加入甲醇與乙醇各25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30分鐘,依法測(cè)定。結(jié)果顯示,采用甲醇提取測(cè)定含量略高,故采用甲醇作提取溶劑為宜。結(jié)果見表5。
表5 提取溶劑的比較
3.2.3 提取溶劑量的考察取同一批次(20090820)供試品粉末0.9 g,精密稱定,置具塞三角瓶中,分別精密加入甲醇25 mL、50 mL、75 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30分鐘,依法測(cè)定。結(jié)果顯示,提取溶劑量為25 mL時(shí)測(cè)得含量較高,故將提取溶劑量定為25 mL。結(jié)果見表6。
3.2.4 提取時(shí)間的考察取同一批次(20090820)供試品粉末0.9 g,精密稱定,置具塞三角瓶中,各精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定重量,分別超聲處理(功率200W,頻率40 kHz)15 min、30 min、45 min,依法測(cè)定。結(jié)果顯示,超聲提取30 min時(shí)供試品中丹參酮ⅡA含量較高,故將提取時(shí)間定為30 min。結(jié)果見表7。
表6 提取溶劑量的考察
3.3 耐用性試驗(yàn)
3.3.1 不同色譜柱的考察分別用DaisoSp-120-5-ODS-AP C18(4.6×250 mm,5 μm)與 AT.LICHROM C18(4.6×150 mm,5 μm)色譜柱,采用BisepTM-1100型高效液相色譜儀,測(cè)定同一批次(20090820)供試品中丹參酮ⅡA含量,二者RSD為0.58%。結(jié)果顯示,不同色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。結(jié)果見表8。
表7 提取時(shí)間的考察
3.3.2 不同儀器的考察采用DaisoSp-120-5-ODS-AP C18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱,分別在BisepTM-1100型與LC-10AD型高效液相色譜儀上,測(cè)定同一批次(20090820)供試品的含量,二者RSD為0.7%。結(jié)果顯示,不同儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。結(jié)果見表9。
表8 不同色譜柱對(duì)含量測(cè)定的影響
表9 不同儀器對(duì)含量測(cè)定的影響
參考文獻(xiàn):
[1]周福成.2010年版《中國(guó)藥典》編制工作報(bào)告[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2010,9(1):9.
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[3]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范2005年版[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005:84.
作者簡(jiǎn)介:劉光斌,男,副主任藥師。研究方向:制劑研究。E-mail:jgyylgb@sina.com
Determination of TanshinoneⅡA in Huoxuejiangmei Powder by HPLC
Liu Guangbin1,Li Huaibiao2,Mao Hepin1(1 Jiugang Hospital of Gansu,Jiayuguan 735100,China;2 Jiayuguan Institute for Drug Control)
ABSTRACTObjective:To develop a HPLC method to determine the contents of TanshinoneⅡA in Radix et RhizomaSalviaeMiltiorrhizaein HuoxuejiangmeiPowder.Methods:Thedetermination wasperformed ona DaisoSp-120-5-ODS-AP(4.6×250 mm 5 μm).The column temperature was set at 30℃.The mobile phase consisted of methanol-water(80∶20).The UV detection wavelength was 270 nm and the flow rate was 1.0 mL/min.Results:The linear range of TanshinoneⅡA was within 0.026 67~0.213 4 μg with a correlation coefficient of 0.999 9.The average recovery was 98.94%andRSDwas 1.27%.Conclusion:The method is accurate,simple,feasible,and can be used effectively for the quality control of Huoxuejiangmei Powder.
KEY WORDSHuoxuejiangmei Powder;HPLC;TanshinoneⅡA