不同產(chǎn)地細(xì)辛中有效成分與馬兜鈴酸Ⅰ含量差異比較

劉雅婧李春杰周英亮張連學(xué)

（1吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2吉林省合龍市科技局，吉林 延吉 133500）

不同產(chǎn)地細(xì)辛中有效成分與馬兜鈴酸Ⅰ含量差異比較

劉雅婧1李春杰1周英亮2張連學(xué)1

（1吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2吉林省合龍市科技局，吉林 延吉 133500）

【摘要】目的：測定不同產(chǎn)地細(xì)辛及其不同入藥部位中的腎毒性成分和有效成分的含量，優(yōu)選出腎毒性成分含量低、有效成分含量高的細(xì)辛藥材品種及產(chǎn)地。方法：HPLC法測定馬兜鈴酸Ⅰ及細(xì)辛脂素的含量；GC法測定甲基丁香酚含量。結(jié)果：不同產(chǎn)地細(xì)辛中，馬兜鈴酸Ⅰ含量以陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛）地下部分最高，為0.452 8 mg/g，以吉林通化（北細(xì)辛）地上部分最低，為0.008 3 mg/g；甲基丁香酚含量以吉林合龍（漢城細(xì)辛）地下部分含量最高，為1.35%，細(xì)辛脂素含量以吉林合龍（漢城細(xì)辛）地下部分含量最高，為3.92 mg/g。結(jié)論：不同產(chǎn)地細(xì)辛馬兜鈴酸Ⅰ、細(xì)辛脂素、甲基丁香酚含量差異較大。

【關(guān)鍵詞】細(xì)辛；馬兜鈴酸Ⅰ；甲基丁香酚；細(xì)辛脂素

細(xì)辛（Herbar Asarum）為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag，漢城細(xì)辛Nakai或華細(xì)辛Asarun sieboldii Miq的根及根莖[1]。具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、溫肺化飲的功效。

細(xì)辛的化學(xué)成分包括甲基丁香酚、黃樟醚、欖香素、桉油精、細(xì)辛醚、細(xì)辛脂素、馬兜鈴酸Ⅰ等。其中，甲基丁香酚為主要有效成分。細(xì)辛脂素是存在于細(xì)辛中的木脂素類化合物，具有抗病毒和抗結(jié)核桿菌的作用[2]。據(jù)文獻(xiàn)報道[3]，細(xì)辛中的馬兜鈴酸Ⅰ有致癌及腎損害作用，“馬兜鈴酸腎病”曾在國際上引起了軒然大波，對我國中藥產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了極不良影響。

另外，關(guān)于細(xì)辛的入藥部位，從古至今多有變更。細(xì)辛在古代據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》，以根入藥。直至近代采用全草入藥，2005版藥典又將其改回根及根莖入藥，故合理的入藥部位有待探究。

現(xiàn)有報道多是集中于單獨對細(xì)辛中的馬兜鈴酸的含量測定，而沒有綜合其有效成分對其進(jìn)行完整的評價。為了篩選好的細(xì)辛藥材產(chǎn)地、優(yōu)選優(yōu)質(zhì)品種，探究其合理入藥部位，本文以馬兜鈴酸Ⅰ、甲基丁香酚、細(xì)辛脂素三種成分為指標(biāo)，采用HPLC、GC手段，對不同產(chǎn)地、不同品種、不同入藥部位的細(xì)辛做了完整的含量差異分析，從而優(yōu)選出腎毒性成分低、有效成分高的細(xì)辛藥材產(chǎn)地，以期為臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料

陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛），2006年8月采于陜西省寧強(qiáng)縣；遼寧清原（北細(xì)辛），2006年8月采于遼寧省清原縣；吉林通化（北細(xì)辛），2006年8月采于吉林省通化縣；吉林左家（北細(xì)辛），2006年8月采于吉林省左家鎮(zhèn)；吉林合龍（漢城細(xì)辛），2007年8月采于吉林省合龍縣。

以上品種均經(jīng)過吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院張連學(xué)教授鑒定。

1.2 藥品

馬兜鈴酸Ⅰ對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110746-200305）；細(xì)辛脂素（上海博蘊生物公司，批號110785-200307）；甲基丁香酚（中國藥品生物制品檢定所，批號111642-200301）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司，批號20050623）；乙腈（色譜純，美國 Fisher公司，批號20021231）。

1.3 儀器

LC-lOAvp高效液相色譜儀(日本島津)；GC-14A氣相色譜儀(日本島津)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量

2.1.1 色譜條件[3，5]C18色譜柱 (200 mm×4.6 mm,5 μm)（大連江申）；流動相：甲醇∶1%冰醋酸（75∶25）；檢測波長：315 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃（波長的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)選擇了多個波長做了對比，在相同條件下：馬兜鈴酸Ⅰ在315 nm處的吸收強(qiáng)度最大，峰型最好）。

2.1.2 對照品溶液的制備精密稱取馬兜鈴酸Ⅰ對照品4.6 mg，用無水乙醇溶解，定容于5 mL容量瓶中。精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，制得濃度為0.092 mg/mL的對照品儲備液。

2.1.3 線性關(guān)系考察取對照品溶液，用無水乙醇配成濃度分別為 9.2 μg/mL、4.6 μg/mL、2.3 μg/mL、1.15 μg/mL、0.575 μg/mL、0.287 5 μg/mL的系列溶液。取五種濃度的對照品溶液分別依次進(jìn)樣20 μL，每份進(jìn)樣3針，記錄峰面積，以馬兜鈴酸Ⅰ量（μg）為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為Y=26 098X+18 912，r=0.999 9。馬兜鈴酸Ⅰ在9.2 μg/mL～0.287 5 μg/mL范圍內(nèi)濃度與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 供試品溶液的制備[3，6]精密稱取細(xì)辛藥材粉末（60目）1g，置25 mL容量瓶中，加入甲醇-10%甲酸水(4∶1)約20mL，浸泡1 h后，超聲提取三次，每次15 min，定容至25 mL，過0.45 μm微孔濾膜，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.5 精密度實驗精密吸取濃度為2.3 μg/mL的對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計算RSD值為0.42%。結(jié)果表明精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗取細(xì)辛藥材陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛）地上部分粉末1份，精密稱定1 g，依2.1.4項下的方法制成供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積值。計算RSD值為0.74%。結(jié)果表明該法穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性實驗取細(xì)辛藥材陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛）地上部分粉末5份，各精密稱定1 g，依2.1.4項下的方法法制成供試品溶液。記錄峰面積值。計算RSD值為1.86%。結(jié)果表明該法有良好的重復(fù)性。

2.1.8 加樣回收率實驗取已知含量的藥材陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛）地上部分粉末5份，各精密稱定1 g，分別精密添加一定量的對照品，按供試品溶液制備方法進(jìn)行提取，含量測定。測得馬兜鈴酸I的平均回收率為98.27%，RSD值為1.16%。結(jié)果表明回收率符合含量測定要求。結(jié)果見表1。

2.1.9 樣品含量測定取不同產(chǎn)地細(xì)辛的藥材粉末，依法制成供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL按2.1.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表2。色譜圖見圖1、圖2。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果(%)

表2 不同產(chǎn)地細(xì)辛馬兜鈴酸Ⅰ含量測定結(jié)果(mg/g)

從表2中可以看出，各產(chǎn)地地下部分與地上部分相比馬兜鈴酸Ⅰ含量達(dá)到0.01的顯著水平。相關(guān)性分析得出r= 0.981，r＞r0.01。地上部分與地下部分的馬兜鈴酸Ⅰ含量的線性相關(guān)關(guān)系有極顯著意義。

2.2 HPLC法測定藥材中細(xì)辛脂素的含量

2.2.1 色譜條件[2]C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)(大連江申)；流動相：乙腈與水進(jìn)行梯度洗脫，乙腈在15 min內(nèi)由15%～100%；檢測波長：287 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

圖1 馬兜鈴酸Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

圖2 細(xì)辛樣品馬兜鈴酸ⅠHPLC色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取細(xì)辛脂素對照品1.5 mg，用乙酸乙酯溶解，定容于5 mL容量瓶中。制得濃度為0.30 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 線性關(guān)系的考察取對照品溶液，用乙酸乙酯配成濃度分別為0.6 μg/mL、1.2 μg/mL、2.4 μg/mL、12 μg/mL、60 μg/mL、300 μg/mL的系列溶液。取六種濃度的對照品溶液分別依次進(jìn)樣20 μL，每份進(jìn)樣3針，記錄峰面積，以細(xì)辛脂素為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為Y=1 546 200X+56 235，r=0.999 9。細(xì)辛脂素在0.012 μg～6.0 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.4 供試品溶液的制備[2]精密稱取細(xì)辛藥材粉末（60目）1g，乙酸乙酯索氏提取器加熱回流提取120 min，乙酸乙酯定容至50 mL。過0.45 μm微孔濾膜，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.5 精密度實驗精密吸取濃度為0.6 μg/mL的對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計算RSD值為3.0%。結(jié)果表明該法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取細(xì)辛藥材陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛）粉末1份，精密稱定1g，依2.2.4項下的方法制成供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積值。計算RSD值為1.24%。結(jié)果表明該法穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性實驗取細(xì)辛藥材陜西寧強(qiáng)（華細(xì)辛）粉末5份，各精密稱定1g，依2.2.4項下的方法制成供試品溶液。記錄峰面積值。計算RSD值為1.65%。結(jié)果表明該法有良好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率實驗取已知含量的藥材吉林左家（北細(xì)辛）粉末5份，各精密稱定1g，分別精密添加一定量的對照品，按供試品溶液制備方法進(jìn)行提取，含量測定。測得細(xì)辛脂素平均回收率為97.81%，RSD值為2.12%。結(jié)果表明回收率符合含量測定要求。結(jié)果見表3。

2.2.9 樣品含量測定取不同產(chǎn)地細(xì)辛的藥材粉末，依法制成供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL按2.2.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表4。色譜圖見圖3、圖4。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果(%)

從表2中可以看出，各產(chǎn)地地下部分與地上部分相比細(xì)辛脂素含量達(dá)到0.01的顯著水平。相關(guān)性分析得出r= 0.909，r＞r0.01。地上部分與地下部分的細(xì)辛脂素的含量線性相關(guān)關(guān)系有極顯著意義。

2.3 GC測定藥材中甲基丁香酚的含量

2.3.1 色譜條件[4]色譜柱：DB-1石英毛細(xì)管柱；柱長：30 m；內(nèi)徑：0.25 mm；柱溫：開始80℃保持3 min，以10℃/min的速率升至240℃；氣化室溫度：280℃；檢測器溫度：280℃；載氣：氮氣；檢測器：FID；進(jìn)樣量：1 μL。

表4 不同產(chǎn)地細(xì)辛細(xì)辛脂素含量測定結(jié)果(mg/g)

圖3 細(xì)辛脂素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

2.3.2 揮發(fā)油提取揮發(fā)油提取按《中華人民共和國藥典》2005年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法項下規(guī)定的方法進(jìn)行。以無水硫酸鈉干燥。

2.3.3 對照品溶液的制備精密量取甲基丁香酚對照品20μL[4]，置于1mL容量瓶中，環(huán)己烷定容至刻度。制得濃度為20 μL/mL的對照品儲備液。

2.3.4 供試品溶液制備[4]將按照2.3.2項下規(guī)定方法提取的細(xì)辛揮發(fā)油，置于10 mL容量瓶中，環(huán)己烷定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.5 線性關(guān)系的考察取對照品溶液配成濃度分別為0.012 5 μL/mL、0.125 μL/mL、0.25 μL/mL、0.5 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL的系列溶液。取六種濃度的對照品溶液分別依次進(jìn)樣1μL，每份進(jìn)樣3針，記錄峰面積，以甲基丁香酚的量為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為Y=225 655X+98 487，r=0.999 8。甲基丁香酚濃度在0.012 5～20 μL/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度實驗精密吸取濃度為0.5 μL/mL的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計算RSD值，RSD值為1.41%。結(jié)果表明該法精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實驗取吉林合龍(漢城細(xì)辛)地下部分樣品溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積值。計算RSD值為0.25%。結(jié)果表明該法穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性實驗取細(xì)辛藥材吉林合龍(漢城細(xì)辛)5份，分別制成樣品溶液，進(jìn)樣分析，測定甲基丁香酚峰面積，計算RSD值為1.51%。結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率實驗取已知含量的藥材吉林通化(北細(xì)辛)5份，制成供試品，分別精密添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行含量測定，測得甲基丁香酚的平均回收率為97.35%，RSD值為1.16%。結(jié)果見表5。

2.3.10 樣品含量測定將依法制得的各個產(chǎn)地和各個部位的細(xì)辛的供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果見表6。色譜圖見圖5、圖6。

圖4 細(xì)辛樣品細(xì)辛脂素HPLC色譜圖

表5 加樣回收率實驗結(jié)果(%)

表6 不同產(chǎn)地細(xì)辛甲基丁香酚含量測定結(jié)果(%)

從表3中可以看出，除陜西寧強(qiáng)(華細(xì)辛)各產(chǎn)地地下部分與地上部分相比甲基丁香酚含量達(dá)到0.01的顯著水平。相關(guān)性分析得出r=0.809，r＞r0.01。地上部分與地下部分的甲基丁香酚的含量線性相關(guān)關(guān)系有極顯著意義。說明地下部分的甲基丁香酚含量明顯高于地上部分。

3 結(jié)果分析與討論

圖5 甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品GC色譜圖

圖6 細(xì)辛樣品甲基丁香酚GC色譜圖

3.1 從不同品種進(jìn)行比較分析：因吉林通化為北細(xì)辛的主要產(chǎn)區(qū)，故將其作為北細(xì)辛品種的代表與其他兩個品種進(jìn)行比較。結(jié)果表明：馬兜鈴酸Ⅰ含量最高的為華細(xì)辛，最低的為北細(xì)辛；細(xì)辛脂素含量最高的為漢城細(xì)辛，最低的為華細(xì)辛；甲基丁香酚含量最高的為漢城細(xì)辛，最低的為華細(xì)辛。

3.2 從細(xì)辛的不同入藥部位來看，有效成分甲基丁香酚和細(xì)辛脂素的含量為地下部分高于地上部分。由此可以看出，古代采用細(xì)辛根入藥以及2005年藥典將細(xì)辛由全草入藥改回根及根莖入藥是合理的。但是，地下部分所含的腎毒性成分也很高，此問題期望通過有效的炮制手段來加以解決。

3.3 因三種成分的地上部分與地下部分含量均具有相關(guān)性且差異顯著，在進(jìn)行育種工作時，可以只取細(xì)辛的地上部分進(jìn)行有效成分與有毒成分的測定，同時保留其地下部分不被破壞，進(jìn)一步作繁殖材料，通過系統(tǒng)選育，有望優(yōu)選出有害成分馬兜鈴酸含量低而細(xì)辛脂素等有效成分含量高的品種。

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張連學(xué)，男，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向：中藥GAP規(guī)范化種植、中藥質(zhì)量評價及中藥活性成分研究。通訊作者E-mail：zlxbooksea@163.com

基金項目：科技部長白山主要中藥材育種與規(guī)范化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究。項目編號（2004DA507A17）

作者簡介：劉雅婧，女，中藥學(xué)碩士。研究方向：中藥化學(xué)。

Determination of Effective Components and Aristolochic AcidⅠ in Asarum Herb from Different Habitats

Liu Yajing1,Zhang Chunhong1,Zhou Yingliang2,Zhang Lianxue1(1 College of Traditional Meteria Medica,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2 HeLong Technology Situation,YanJi 133500)

ABSTRACTObjective:Determinning both components of harmful aristolochic acidⅠand effective elements of asarinin and methyleugenol in herba asari (Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag, Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai and Asarun sieboldii Miq),to optimize the herb origin and its native habitat with the herb being high components and low nephrotoxicity.Method:Aristolochic acidⅠand asarinin were determined by HPLC;methyleugenol was determined by GC.Results:Among these herba asari,the highest content of aristolochic acidⅠwas 0.452 8 mg/g that form NingQiang Shannxi root,the lowest content of it was 0.008 3 mg/g that from Tonghua Jilin root.The highest contents of methyleugenol was 1.35%that from Helong Jilin root and the highest contents of asarinin was 3.92 mg/g that from Helong Jilin root.Conclusion:There was evident different in the contents of aristolochic acidⅠ,asarinin,and methyleugenol in herba asari from different habitats.

KEY WORDSAsarum;Aristolochic acidⅠ;Asarinin;Methyleugenol