平白術(shù)多糖的分離純化及IR、GC分析

譚 敏，邱細(xì)敏★，陸艷艷，陳 文，曾 明，于業(yè)芳

（1湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz)的干燥根莖，性溫，味甘、苦，歸脾、胃經(jīng),具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎等作用[1]。主產(chǎn)于浙江、安徽、湖南、湖北、江西等地[2]。近年來，白術(shù)多糖的增強(qiáng)免疫功能，抗氧化，降血糖等作用越來越受到關(guān)注，其獨(dú)特的功能，有望成為一種極具開發(fā)潛力和開發(fā)價(jià)值的保健品和藥品[3-6]。多糖所具有的藥理活性往往與其結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)，因此對(duì)于具有藥理活性的多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)方面的深人研究顯得越來越重要[7]。本文對(duì)湖南平江白術(shù)多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)其進(jìn)行組成分析，為進(jìn)一步弄清結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供試驗(yàn)資料，也為充分利用和發(fā)展湖南平江白術(shù)具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白術(shù)藥材（購(gòu)置湖南平江，由湖南師范大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室鑒定為菊科植物白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz)的干燥根莖）；DEAE-纖維素（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、半乳糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀GC4000A series（北京東西分析儀器有限公司）；HGT-300E氮、氫、空氣發(fā)生器（北京匯龍公司）；OV-101毛細(xì)管柱（30m×0.53×0.5μm）；NICOLET 5700傅里葉紅外光譜儀 （Perkin Elmer公司）；電子分析天平（AUY 120,SHIMADZU）；冷凍干燥機(jī) （北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （鞏義市英峪予華儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.3 多糖的分離與純化

1.3.1 平白術(shù)多糖的提取與純化[8]

精密稱取平白術(shù)粗粉50 g,100℃水提2 h,濾渣反復(fù)提取三次，合并水提液,濃縮。濃縮液用乙醇、丙酮反復(fù)洗三次,沉淀冷凍干燥，即得平白術(shù)粗多糖（CAMP）。取CAMP適量用蒸餾水溶解，加三氯乙酸至10%，攪拌30 min靜置過夜。離心，取上清液，重復(fù)多次，直至在260-280 nm范圍內(nèi)無吸收。加入30%過氧化氫至1%，脫色3～4 h，NaOH調(diào)節(jié)pH至8～9，抽濾濃縮，冷凍干燥，得純化平白術(shù)精多糖（RAMP）。

1.3.2 平白術(shù)多糖的精制

取RAMP溶于少量蒸餾水中，DEAE-纖維素色譜柱進(jìn)行分離,分別用蒸餾水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl洗脫，流速 1ml/ min，每10分鐘收集一管，隔管用蒽酮-硫酸法[9]測(cè)定吸光度值,收集各洗脫液。

1.4 組成研究

1.4.1 紅外光譜測(cè)定[10]

將光譜純KBr在160℃烘干6 h，貯于干燥器中備用。采用KBr壓片法，取RAMP 2 mg，KBr 150 mg，用研缽研磨細(xì)，KBr空白片作參比，在4000～400cm-1區(qū)間掃描。

1.4.2 氣相色譜分析

1.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化[11]精密稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)單糖于試管中,加入10 mg鹽酸羥胺，加入0.5 mL吡啶,振蕩混勻,加入90℃水浴中加熱反應(yīng)。取出后冷卻至室溫,加入0.5 mL醋酸酐,在90℃下繼續(xù)反應(yīng)進(jìn)行乙?；０凑丈鲜龇椒?取標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物0.1μL進(jìn)行氣相色譜分析。

1.4.2.2 RAMP水解和衍生化

精密稱取15 mgRAMP,加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液,振蕩,將溶液轉(zhuǎn)移到安瓶中,充N2后封口,置于100℃加熱水解4 h。取出置于60℃水浴中吹干。將水解后的RAMP按照標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化的方法,將其衍生化,取樣1μL進(jìn)行氣相色譜分析。

1.4.2.3 氣相色譜分析條件

升溫程序:初始柱溫130℃,以2℃/min的升溫速率升至150℃,以3℃/min升至210℃,維持20 min；N2流速為 10 mL/min,H2流速為20 mL/ min,空氣流速為300 mL/min,進(jìn)樣溫度為130℃，柱溫為250℃，檢測(cè)器溫度為280℃。

2 結(jié)果

2.1 平白術(shù)多糖的純化結(jié)果

RAMP經(jīng)DEAE-纖維素柱分離純化后得到3個(gè)主要洗脫峰RAMP-1,RAMP-2,RAMP-3,其中蒸餾水洗脫組分所占比例最大，為平白術(shù)多糖的主要組分。

2.2 RAMP的純度鑒定

將RAMP在200～700 nm紫外掃描，260～280 nm無明顯的吸收峰,紫外譜圖顯示樣品中無蛋白質(zhì)、核酸。

2.3 結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 RMAP的紅外光譜圖[10，12]

圖1 RMAP的紅外光譜圖

從圖1可見，紅外光譜圖在3378cm-1為糖OH伸縮震動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，且存在分子間氫鍵。2928 cm-1為C-H伸縮振動(dòng)，1645 cm-1的吸收為少量羰基的吸收峰，1460～1350 cm-1處的吸收峰為-OH的變形振動(dòng)，表明該組分為多聚糖，含末端甲基類單糖。1429.3 cm-1處的吸收峰是C-H的變角震動(dòng)，是糖環(huán)的特征吸收，1031 cm-1為C-O鍵的伸縮振動(dòng)，988.8 cm-1處的吸收峰是脫氧糖的次甲基的橫搖振動(dòng)引起，937.1 cm-1是呋喃環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)所造成的，875.1 cm-1是吡喃糖β-型C-H的變角振動(dòng)的特征吸收峰，819.0 cm-1是呋喃環(huán)的C-H變角振動(dòng)。1644.5、1141.5、1194.8、1337.2、1031 cm-1處的吸收峰說明該多糖含糖醛酸這些吸收均為糖的特征吸收位置。

2.3.2 單糖的組成分析

圖2 ：RAMP的氣相色譜圖

圖3.混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的氣相色譜圖

根據(jù)單糖對(duì)照品和樣品的色譜保留時(shí)間,將RAMP水解產(chǎn)物的糖睛乙酰酯衍生物的氣相色譜圖(圖2)與混合單糖對(duì)照品的氣相色譜圖(圖3)對(duì)照比較，同時(shí)在樣品的混合單糖衍生物的色譜峰中逐一加人標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物,從混合單糖色譜峰面積變化,鑒定出相應(yīng)單糖峰,結(jié)果可知RAMP單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。

3 討論

多糖水解是試驗(yàn)過程關(guān)鍵的一步，可采用硫酸、三氟乙酸等方法。但高濃度的硫酸易造成多糖的碳化，使圖譜復(fù)雜化，而低濃度的硫酸水解不完全，分析靈敏度降低，故采用三氟乙酸水解。試驗(yàn)中比較2mol/L，4mol/L三氟乙酸的水解效果，發(fā)現(xiàn)2 mol/L三氟乙酸法水解平白術(shù)多糖氣相色譜的響應(yīng)值較高。

糖腈乙酸酯衍生化氣相色譜法可得到單糖的單一色譜峰,能用于單糖組分分析，對(duì)未知結(jié)構(gòu)多糖的分析十分重要。本實(shí)驗(yàn)得到的白術(shù)多糖的單糖組成與文獻(xiàn)報(bào)道的不完全一致[13]，可能是因?yàn)楫a(chǎn)地不同。有關(guān)平白術(shù)多糖的組成與生物活性之間的關(guān)系,有待進(jìn)一步深入研究。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典[P].2005年版，

一部，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：68.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上冊(cè) .上海：上海科技出版社,1985.1376.

[3]陳文，何鴿飛，姜曼花，等.近10年白術(shù)的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（2）：338－340.

[4]湯新慧.白術(shù)多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中醫(yī)研究，1998，11（2）：7-9.

[5]徐麗珊，金曉玲，邵鄰相.白術(shù)及白術(shù)多糖對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶和抗氧化作用的影響[J].科技通報(bào)，2003，16（6）：513-515.

[6]單俊杰，田庚元.白術(shù)糖復(fù)合物AMP-B的理化性質(zhì)及降血糖活性的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（6）：438-441.

[7]RoutD,Mondals,Chakraborty I，et al.The structure of a polysaccharide from Fraction-II of an edible mushroom, Pleurotus florida[J].Carbohydr Research,2006,341:995-1002.

[8]劉芳，朱學(xué)慧，劉玫，等.冬凌草多糖脫蛋白和脫色方法的研究[J].中藥材，2008,5(31):751-753.

[9]李紹平，黃趙剛，張平，等.蒽酮-硫酸法測(cè)定亮菌糖漿中多糖的含量[J]，中草藥，2001，32(2):124.

[10]張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1999，121-128.

[11]康學(xué)軍，曲見松.白芷多糖中單糖組成的氣相色譜分析[J].藥物分析雜志，2006,26(7):891-894.

[12]劉 榮，王向宏，李佳梅,等.柳蒿芽多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)初步分析[J].食品科學(xué)，2009，30（13）：81-83.

[13]梁中煥，郭志欣，張麗萍.白術(shù)水溶性多糖的結(jié)構(gòu)特征[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：185-188.