重組弓形蟲致密顆粒蛋白7的表達(dá)及免疫活性分析

袁仕善，孫文霞，陳 婧，唐小異，鄢 慧

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，湖南 長沙 410006）

重組弓形蟲致密顆粒蛋白7的表達(dá)及免疫活性分析

袁仕善，孫文霞，陳 婧，唐小異，鄢 慧

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，湖南 長沙 410006）

目的：重組表達(dá)弓形蟲致密顆粒蛋白7（GRA7），分析其免疫活性。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從剛地弓形蟲基因組DNA中擴(kuò)增GRA7基因,經(jīng)克隆和測序分析后，亞克隆至表達(dá)載體pET-23a（+）,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)GRA7,用His-bindTM親和層析柱純化，免疫印跡和小鼠免疫分析其抗原性。結(jié)果：PCR擴(kuò)增出大小約660bp的GRA7基因片段,并被亞克隆到原核表達(dá)載體pET-23a（+）,構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-GRA7；表達(dá)純化獲得分子量約29，000的重組GRA7；重組GRA7能被弓形蟲感染兔血清所識別，并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體滴度達(dá)1：12800。結(jié)論：獲得了具有良好免疫學(xué)活性的重組抗原GRA7。

弓形蟲；致密顆粒蛋白7；表達(dá)；抗原性

弓形蟲是寄生于人體和許多動物組織細(xì)胞的機(jī)會致病性原蟲，可侵犯脊椎動物的多種細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)繁殖，最后破壞宿主細(xì)胞，釋放出蟲體，導(dǎo)致一系列病理變化。弓形蟲病已成為一個世界性的公共衛(wèi)生問題，引起了醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)學(xué)界的高度重視。建立靈敏特異的弓形蟲病診斷方法，研制弓形蟲疫苗,對有效控制弓形蟲感染、提高人口素質(zhì)具有重要意義。致密顆粒蛋白7（GRA7）是一種分子量為29kDa的弓形蟲致密顆粒蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫和全身免疫，對弓形蟲病具有一定的保護(hù)作用，被認(rèn)為是一種有潛力的疫苗候選分子[1]；并能刺激機(jī)體強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答，是一種診斷弓形蟲感染的有效抗原[2]。本文利用原核表達(dá)載體pET-23a（+）構(gòu)建GRA7的原核重組表達(dá)質(zhì)粒,并予表達(dá)、純化和免疫活性分析,以期為弓形蟲GRA7用于弓形蟲病診斷和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株和實(shí)驗(yàn)動物

剛地弓形蟲RH株由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室何立教授贈送。雄性昆明鼠，體重202克，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 菌株、質(zhì)粒 表達(dá)載體pET-23a（+）及大腸埃希菌JM109和BL21由本室保種。pMD18-T載體購自大連寶生物工程公司。

1.3 儀器與試劑

TC-412型PCR儀系英國TECHNE公司生產(chǎn)；5840R型高速冷凍離心機(jī)系德國Eppendorf公司生產(chǎn)。DYCZ-240型電泳槽、DYCZ-400型轉(zhuǎn)印槽、DYY-12C型三恒多功能電泳儀電源系北京六一儀器廠生產(chǎn)。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖、十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶K、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）系美國Amresco公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)分子量 DNA、TaqDNA聚合酶、pMD18-T載體、T4DNA連接酶。限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和SalI、DNA的膠回收純化試劑盒系大連寶生物工程公司產(chǎn)品。預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)系美國 New England Biolabs公司產(chǎn)品。質(zhì)粒DNA小量提取試劑系北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。His-Binding Resin系美國Novogen公司產(chǎn)品。硝酸纖維素（NC）膜系美國Bio-rad公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG系美國PIERCE公司產(chǎn)品。DAB顯色試劑盒系北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其它試劑系國產(chǎn)分析純。

1.4 弓形蟲感染兔血清的制備

取約100個弓形蟲速殖子，腹腔接種健康家兔，每天觀察其癥狀，于第30d重復(fù)接種一次，第60d時心臟采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 弓形蟲速殖子基因組

DNA的提取弓形蟲速殖子感染健康小鼠3天后,從小鼠腹水中收集弓形蟲速殖子,PBS洗滌,重懸于0.2mL含1%SDS的STE（pH8.0的10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、0.15mmol/L NaCl）液中,補(bǔ)加蛋白酶K至0.1mg/mL,37℃消化過夜；用等體積的飽和酚、飽和酚氯仿、氯仿各抽提一次,無水乙醇沉淀DNA,溶于TE中,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 GRA7基因的體外擴(kuò)增和克隆

使用如下引物：引物F：5'—GGATCC GCCAC CGCGTCAG—3',引物R：5'—GTCGAC GCGGGCATCCTC—3'。以弓形蟲基因組DNA為模板擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30sec,58℃退火30sec,72℃延伸1min,共35個循環(huán)；72℃延伸5min、1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物、切膠回收,與T載體pMD18-T于16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR和質(zhì)粒DNA序列分析鑒定陽性菌株。

1.7 GRA7原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

擴(kuò)增陽性克隆的菌株和含pET-23a（+）的菌株,抽提并純化含正確的插入片段的pMD18-T的質(zhì)粒和pET-23a（+）質(zhì)粒,pET-23a（+）質(zhì)粒用BamH I和SalI進(jìn)行雙酶切,含正確的插入片段的pMD18-T的質(zhì)粒用 BamH I酶切 6h后，補(bǔ)加 SalI酶切40min,1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的片段和載體,將酶切后的表達(dá)載體和目的片段進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA,用PCR和部分雙酶切鑒定陽性重組子。

1.8 重組GRA7的表達(dá)和純化

將構(gòu)建好的重組表達(dá)菌株于37℃振蕩培養(yǎng)過夜,轉(zhuǎn)換新鮮的 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 4h，3 500g離心10min，收集菌體；含0.15mol/LNaCl的20mmol/L pH7.9 Tris-HC重懸菌體，反復(fù)凍融三次，冰浴超聲，4℃,12 000g離心20min,取上清，按照試劑盒使用說明，用HisbindTM柱純化蛋白，12%SDS-PAGE和免疫印跡分析。血清為1：500稀釋的弓形蟲感染兔血清，二抗為1：2000的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。

1.9 重組蛋白的免疫活性分析

雄性昆明鼠20只，隨機(jī)分兩組，分別為GRA7免疫組和完全弗氏佐劑（FCA）組。于0、2、4周經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射分別免疫重組GRA7（20μg蛋白和50μL佐劑）和FCA（50μL生理鹽水和50μL佐劑）。第 6周采血，以免疫前血清為對照，用 1μg/孔GRA7包板，間接ELISA測定測定抗體滴度，抗體滴度達(dá)1：6400以上時，摘眼球采血，收集血清，-20℃凍存。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲GRA7基因的擴(kuò)增與克隆

采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出GRA7基因片段，大小約為660bp，與預(yù)期目的片段相符（圖1）。將菌落PCR鑒定為陽性的兩個克隆進(jìn)行測序，并與Gen-Bank中GRA7基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩個克隆均在同一位置存在同一類型的堿基突變，即183位堿基由A變?yōu)門，為同義突變，編碼的氨基酸仍為脯氨酸。本文選擇2號克隆進(jìn)行GRA7的重組表達(dá)。

2.2 GRA7重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切后用SalⅠ部分酶切以及重組質(zhì)粒的PCR見圖2。由圖2可知，部分雙酶切和PCR鑒定均出現(xiàn)一條大小約為660bp的電泳帶，與理論值大小一致。此外部分雙酶切還出現(xiàn)兩條分子量大于2000bp的條帶，分別為含有外源基因GRA7的重組質(zhì)粒和切去外源基因GRA7后的載體DNA。

圖1 弓形蟲RH株GRA7基因PCR擴(kuò)增

圖2 pET-GRA7重組子PCR和酶切鑒定

2.3 重組GRA7的純化與鑒定

含GRA7的菌體裂解液上清經(jīng)His-bindTM柱親和層析后，SDS-PAGE分析顯示主要蛋白為GRA7的融合蛋白，分子量約結(jié)果見圖3。由圖3可知，重組GRA7分子量大小的介于25 000至33 000之間，約29 000，與理論值相符。免疫印跡分析表明，純化的GRA7能被弓形蟲速殖子感染兔血清所識別（圖4），說明純化的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖3 純化GRA7的電泳圖譜

圖4 純化GRA7的免疫印跡圖譜

圖5 GRA7誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度圖Fig.5 antibodies titre induced by recombinant GRA7

2.4 重組GRA7誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答

以免疫前混合血清為對照，用1μg/孔重組GRA7包板，間接ELISA測定測定第三次免疫后各組抗體滴度，結(jié)果見圖5。由圖示可知，當(dāng)血清稀釋度達(dá)1：12800時，GRA7組450nm的光吸收值仍明顯高于FCA組，表明GRA7誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗體應(yīng)答。

3 討論

弓形蟲感染所致的弓形蟲病可造成人和動物多種組織、器官的病變和損傷，并可通過母嬰垂直傳播而造成胎兒畸形、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等，引起流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎；對免疫功能低下,例如艾滋病的患者、器官移植后長期使用免疫抑制者、腫瘤化療者，常是致死的主要病因，引起了醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)學(xué)界的普遍重視。

致密顆粒蛋白（GRA）是弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后由致密顆粒細(xì)胞器釋放入納蟲泡內(nèi)的一類分泌代謝抗原[3]。自1989年Cesbron-Delauw等[4]首先報道GRA1以后，諸多學(xué)者對致密顆粒蛋白進(jìn)行了系列的研究，目前已發(fā)現(xiàn)致密顆粒細(xì)胞器分泌的蛋白有16種，即GRA1-12、兩種核苷三磷酸水解酶和兩種蛋白酶抑制劑[5-6]。GRA在宿主與寄生蟲的相互作用中起重要作用[7，8]，對人體和動物具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和免疫原性[9-11]，在弓形蟲病診斷和免疫預(yù)防的研究中受到廣泛關(guān)注。Bonhomme等[1]和Jacobs等[2]的研究表明，弓形蟲感染可產(chǎn)生GRA7的高滴度抗體，且GRA7可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，提示GRA7具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。鄭斌等[12]發(fā)現(xiàn)弓形蟲RH株、ZS2株及GT株的GRA7基因高度保守，序列相同，且重組表達(dá)的GRA7具有良好的免疫反應(yīng)性[13]。Velmurugan等[14]在大腸埃希菌中重組表達(dá)了弓形蟲GRA7，免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附測定證明重組GRA7具有良好的反應(yīng)原性，可用于弓形蟲急性感染的診斷。Sadeghiani等[15]重組表達(dá)了弓形蟲GRA7，免疫印跡分析表明重組GRA7能與弓形蟲急性感染人血清反應(yīng)，與慢性感染血清反應(yīng)弱，陰性血清無反應(yīng)，提示重組GRA7可用于研制弓形蟲感染的診斷試劑盒。Jongert等[14]發(fā)現(xiàn)GRA1和GRA7的質(zhì)粒DNA混合物免疫小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體，產(chǎn)生大量分泌IFN-γ的脾細(xì)胞，并使感染小鼠腦包囊負(fù)荷下降89%；低劑量單一基因的DNA免疫，僅GRA7誘導(dǎo) IFN-γ生成并產(chǎn)生強(qiáng)的保護(hù)作用，提示GRA7在弓形蟲DNA疫苗組成中非常重要，是混合DNA疫苗的主要成分。皮內(nèi)免疫GRA1和GRA7 DNA疫苗混合物產(chǎn)生高滴度的抗GRA1、GRA7及弓形蟲裂解產(chǎn)物的抗體,攻擊感染后檢測到淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ生成，提示DNA疫苗可有效抵抗弓形蟲感染[16]。這些研究已證明，弓形蟲GRA7是弓形蟲病的一種重要診斷抗原和疫苗候選抗原。

本文從弓形蟲RH株基因組DNA中擴(kuò)增到編碼GRA7的基因片段,經(jīng)DNA序列分析與Gen-Bank中登錄的序列一致。將GRA7基因片段插入原核表達(dá)載體pET-23a（+），成功構(gòu)建了GRA7的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-GRA7。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，親和層析純化獲得GRA7的融合蛋白。Western印跡分析發(fā)現(xiàn)，純化的重組蛋白可以被弓形蟲感染兔血清所識別,出現(xiàn)陽性反應(yīng)帶，表明表達(dá)純化的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性；將純化的重組抗原免疫小鼠，產(chǎn)生了高滴度的抗體，表明重組表達(dá)的抗原具有良好的免疫原性。具有良好抗原性GRA7的獲得為其用于弓形蟲病診斷和疫苗研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

[1]Bonhomme A,Maine GT,Beorchia A,et al.Quantitative immunolocalization of a P29 protein（GRA7）,a new antigen oF Toxoplasma gondii[J].J Histochem Cytochem,1998,46（12）：1411-1422.

[2]Jacobs D,Vercammen M,Saman E.Evaluation of recombinant dense granule antigen 7（GRA7）of Toxoplasma gondii for detection of immunoglobulin G antibodies and analysis of a major antigenic domain[J].Clin Diagn Lab Immunol，1999,6（1）：24-29.

[3]Tilley M,Ficheram F,Jerom ME,et al.Toxoplasma gondii sporozoites form a transient parasitophorousvacule that is impermeable and contains only a subset of dense granule proteins[J].Infect Immun,1997,65（11）：4598-4605.

[4]Cesbron-Delauw MF,Guy B,Torpier G,et al.Molecular characterization of a 23-kilodalton major antigen secreted by Toxoplasma gondii[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989；86（19）：7537-7541.

[5]Michelin A,Bittame A,Bordat Y,et al.GRA12,a Toxoplasma dense granule protein associated with the intravacuolar membranous nanotubular network[J].Int J Parasitol，2009,39（3）：299-306.

[6]Mercier C,Adjogble KDZ,D？ubener W,et al.Dense granules：Are they key organelles to help understand the parasitophorous vacuole of all apicomplexa parasites[J].Int J Parasitol,2005,35（8）：829-849.

[7]Cesbron-Delauw MF.Dense granule organelles of Toxoplasma gondii：their role in the host-parasite relationship [J].Parasitol Today,1994，10：293-296.

[8]Ahn HJ,Kim S,Nam HW,et al.Host cell binding of GRA10,a novel,constitutively secreted dense granular protein from Toxoplasma gondii[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,3331（2）：614-620.

[9]Pietkiewicz H,Hiszczynska-Sawicka E,Kur J,et al.Usefulness of Toxoplasma gondii-Speci.c Recombinant Antigens in Serodiagnosis of Human Toxoplasmosis[J].J Clin Microbiol,2004,42（4）：1779-1781.

[10]Aubert D,Maine GT,Villena I,et al.Recombinant antigens to detect Toxpolasma Gondii-specific immunoglobulin G and immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassay[J].J Clin Microbiol,2003,38（3）：1144-1150.

[11]Golkar M,Azadmaneshb K,Khalili G,et al.Serodiagnosis of recently acquired Toxoplasma gondii infection in pregnant women using enzyme-linked immunosorbent assays with a recombinant dense granule GRA6 protein[J].Digan Microbiol Infect Dis,2008,61（1）：31-39.

[12]鄭斌,鄭煥欽,何藹,等.弓形蟲不同分離株致密顆粒蛋白基因的序列分析及其在大腸埃希菌中的表達(dá)[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2005,23（2）：100-105.

[13]鄭斌,余南,李卓雅,等.弓形蟲致密顆粒蛋白基因的表達(dá)及其重組蛋白免疫反應(yīng)性的評價[J].中國人獸共患病雜志,2005,21（2）：119-121.

[14]Velmurugan GV,Tewari AK,Rao JR et al.High-level expression of SAG1 and GRA7 gene of Toxoplasma gondii（Izatnagar isolate）and their application in serodiagnosis of goat toxoplasmosis[J].Vet Parasitol,2008,154（3-4）：185-192.

[15]Sadeghiani G,Zare M,Babaie J,et al.Heterologous production of dense granule GRA7 antigen of Toxoplasma gondii in Escherichia coli.Southeast Asian[J]J Trop Med Public Health.2009,40（4）：692-700.

[16]Jongert E,de-Craeye S,Dewit J,et al.GRA7 provides protective immunity in cocktail DNA vaccines against Toxoplasma gondii[J].Parasite Immunol,2007,29（9）：445-453.

[17]J ongert E,Melkebeek V,de-Craeye S,et al.An enhanced GRA1-GRA7 cocktail DNA vaccine primes anti-Toxoplasma immune responses in pigs[J].Vaccine,2008,26（8）：1025-1031.

Recombinant Expression and Immunological Activites of Dense Ggranule Antigen 7 from Toxoplasma Gondii

YUAN Shi-shan,SUN Wen-xia,CHEN Jing,TANG Xiao-yi,YAN Hui
（Molecular Lab.of Medical college in Hunan Normal University.Changsha 410013，China）

Objective To express recombinant Toxoplasma gondii（T.gondii）Dense granule antigen 7（GRA7）in E.coli and analyze its immunological activites.M ethods DNA fragment encoding the GRA7 antigen of T.gondii was obtained from the total DNA of T.gondii RH strains by polymerase chain reaction（PCR）.The gene was cloned and the DNA sequence was determined subsequently.The gene with correct sequence was subcloned into a expression vector pET-23a（+）and was transformed into Escherichia coli BL21 for expression.The expressed fusion protein induced by IPTG was purified by His-bindTM affinity chromatography,and the purified fusion protein was analyzed by Western-blot and immunization in mice for its antigenicity.Results A 660bp gene fragment encoding GRA7 was amplified by PCR from T.gondii genomic DNA；The insert of GRA7 gene in positive clone was subcloned into pET-23a（+）properly to construct a recombinant expression plasmid pET-GRA7.The fusion protein with molecular weight about 29 000 was purified by His-bindTMaffinity chromatography from lysate of the induced E.coli BL21 containing recombinant expression plasmid pET-GRA7.Recombinant protein GRA7 was recognized by rabbit sera infected with T.gondii tachyzoites and induced antibodies with a titre of 1：12 800. Conclusion Recombinant protein GRA7 with good immunological activites was obtained through cloning and expression.

Toxoplasma gondii；dense granules antigen 7；polymerase chain reaction；expression； antigenicity

R382.5

A

1673-016x（2010）01-0017-05

2009-12-20

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃課題（B2005109）

袁仕善，（1968-），男，湖南綏寧人，副教授，主要從事病原分子生物學(xué)研究，E-mail：yuanshishan@yahoo.com.cn