HPLC-PDA測(cè)定銀屑靈流膏中5種成分含量

陳有軍， 趙瑞芝， 趙 瑩， 盧傳堅(jiān)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006)

銀屑靈為廣東省中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，處方來(lái)源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)名老中醫(yī)禤國(guó)維教授。由當(dāng)歸、赤芍、川芎、金粟蘭、土茯苓、烏梅、甘草等十味藥物組成，臨床用于治療銀屑病，效果良好。為確保療效，更好的服務(wù)于臨床，本實(shí)驗(yàn)以HPLC-PDA建立了測(cè)定銀屑靈流膏中綠原酸、芍藥苷、異秦皮啶、阿魏酸和落新婦苷5個(gè)成分含量的方法，可用于銀屑靈制劑的質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器 美國(guó)Waters高效液相色譜儀，包括600四元梯度泵、2998 Photodide Arryay Detector、717 plus Autosample和Empower工作站;電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);超純水機(jī)(Milipore公司);離心機(jī)(G 20河北省安新縣白洋離心機(jī)廠);超聲儀(BOLONG上海波龍電子設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥與試劑 銀屑靈流膏由本實(shí)驗(yàn)室自制;綠原酸(110753-200413)、芍藥苷(0736-9913)、異秦皮啶(110837-200304)、阿魏酸(0773-9910)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;落新婦苷購(gòu)自廣州醫(yī)藥工業(yè)研究所(批號(hào):0901231);甲醇(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，HPLC級(jí));無(wú)水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠AR);冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，HPLC級(jí))。

1.3 供試品溶液制備 銀屑靈方以水常規(guī)提取濃縮后得流膏(含藥材2.9 g/mL)，精密量取流膏0.5 mL，加入10倍量的無(wú)水乙醇，充分混合使沉淀，3 000 r/min離心5 min，傾取上清液，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇洗滌兩次，每次1mL，合并醇液，65℃水浴蒸干，殘?jiān)约状?0.1%冰醋酸(70∶30)溶液溶解成10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液作供試品溶液。

1.4 對(duì)照品溶液配制 取綠原酸、異秦皮啶、落新婦苷、芍藥苷、阿魏酸適量，精密稱定，以甲醇溶解并定容至10 mL，作貯備液。精密量取各標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，以甲醇-0.1%冰醋酸(70:30)溶液配制成含綠原酸 10.62 μg/mL、異秦皮啶 3.85 μg/mL、阿魏酸3.28 μg/mL、落新婦苷26.30 μg/mL、芍藥苷139.79 μg/mL的混合溶液10 mL作對(duì)照品溶液。

1.5 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%冰醋酸，0～10 min(10 ∶90～30 ∶70)，10～40 min(30 ∶70～40 ∶60);流速為 1.0 mL/min;綠原酸、異秦皮啶、阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，落新婦苷為289 nm，芍藥苷為230 nm;進(jìn)樣體積10 μL;柱溫為室溫。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 取對(duì)照品溶液和供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，結(jié)果5種成分與其它成分均達(dá)到基線分離，見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 HPLC色譜圖(320 nm)A.混合對(duì)照品 B.供試品 C.陰性樣品(處方中除去當(dāng)歸、川芎、生地、金粟蘭、土茯苓、烏梅等含以上成分的藥材)1.綠原酸 2.異秦皮啶 3.阿魏酸 4.落新婦苷Fig.1 HPLC chromatogram(320 nm)A.the mixture of chemical reference substance B.sample C.negative sample 1.chlorogenic acid 2.isofraxidin 3.ferulaic acid 4.astilbin

2.2 色譜峰確認(rèn) 取5種標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液各20 μL，混合后稀釋至1 mL，按1.5項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄結(jié)果，在所得的色譜圖上提取各成分的PDA特征光譜圖，并添加到新建的“銀屑靈對(duì)照品”光譜庫(kù)。取供試品溶液進(jìn)樣10 μL，將所得的HPLC色譜與“銀屑靈對(duì)照品”光譜庫(kù)進(jìn)行譜庫(kù)匹配處理，結(jié)合保留時(shí)間和匹配結(jié)果確認(rèn)樣品中的色譜峰。

2.3 線性關(guān)系考察 取1.4項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2.5、5、10、20、30 μL，按2.1 項(xiàng)中的色譜條件測(cè)定5種成分的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程，見(jiàn)表1。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，以各物質(zhì)峰面積計(jì)算，RSD值分別為:綠原酸1.77%，異秦皮啶 2.35%，阿魏酸1.62%，落新婦苷1.72%，芍藥苷2.35%，表明精密度良好。

圖2 HPLC色譜圖(230 nm)A.芍藥苷對(duì)照品 B.供試品 C.陰性樣品(處方中除去赤芍)Fig.2 HPLC chromatogram(230 nm)A.peoniflorin reference substance B.sample C.negative sample

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of linear test

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫放置，分別于 0、1.5、5.5、8.5、10、15 h 進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD值分別為綠原酸3.03%，芍藥苷2.86%，異秦皮啶1.80%，阿魏酸1.94%，落新婦苷2.65%，說(shuō)明供試品在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取已測(cè)定含量的銀屑靈流膏9份，每份0.5 mL，分低、中、高3個(gè)劑量組分別加入各成分對(duì)照品適量，每組3份，按上述樣品處理方法處理，測(cè)定。計(jì)算各劑量組樣品的平均回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種成分的提取回收率(n=3)Table 2 Recoveries of five components(n=3)

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，按上述方法測(cè)定，各成分的RSD分別為:綠原酸0.09%，芍藥苷1.24%，異秦皮啶0.26%，阿魏酸1.70%，落新婦苷2.46%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性較好。

2.8 樣品測(cè)定 精密量取3個(gè)批次的銀屑靈流膏樣品每批3份，每份0.5 mL，以上述方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of samples(n=3)

3 討論

銀屑靈處方藥味眾多，其中的化學(xué)成分復(fù)雜，成分間性質(zhì)差異大，為了使各成分達(dá)到良好的分離，在方法建立過(guò)程中，主要對(duì)流動(dòng)相組成及洗脫方式進(jìn)行了篩選。我們以甲醇、乙腈、0.1%冰醋酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.08%醋酸銨溶液以及水等進(jìn)行了不同組合的篩選，在洗脫方式上，我們實(shí)驗(yàn)了等度及不同梯度對(duì)樣品分離的比較，結(jié)果以甲醇-0.1%冰醋酸梯度洗脫分離較理想，因此最終確定該色譜方法。

基于不同成分紫外吸收特征的不同，為了提高檢測(cè)靈敏度，在定量時(shí)我們采用了物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)或與之相接近的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，如芍藥苷選擇了230 nm用作定量時(shí)的波長(zhǎng)，落新婦苷選擇289 nm，取得了理想的結(jié)果。

HPLC法在藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用非常普遍，但對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，在達(dá)到較好分離后，由于色譜峰眾多，分布密集，tR大多非常接近，單以tR與對(duì)照品一致的方法對(duì)各成分進(jìn)行辨識(shí)存在較大的不確定性。光電二極管陣列檢測(cè)器(photodiode array;PDA)是HPLC最常用的檢測(cè)器之一，該檢測(cè)器可以獲得色譜中各組分的吸收光譜。PDA光譜目前已廣泛用于色譜峰的純度檢查、定性分析、選擇被測(cè)成分最大吸收波長(zhǎng)以及建立藥物多個(gè)特征吸收波長(zhǎng)下的指紋圖等，大大拓展了PHLC的應(yīng)用范圍［1-3］。本實(shí)驗(yàn)在樣品測(cè)定中采用PDA譜-庫(kù)匹配處理，以色譜和光譜雙重標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各成分進(jìn)行了識(shí)別與歸屬，保證了樣品中成分的色譜峰光譜與對(duì)照品一致，提高了方法的專屬性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的方法同時(shí)測(cè)定了銀屑靈復(fù)方流膏中5種成分，該法方便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，各成分分離度較好，可用于銀屑靈制劑及其中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

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