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    槲寄生藥材的高效液相指紋圖譜研究

    2010-05-26 06:15:00徐海燕于治國趙云麗
    中成藥 2010年9期
    關(guān)鍵詞:槲寄生指紋藥材

    于 淼, 徐海燕, 李 飛, 于治國, 趙云麗*

    (1.沈陽藥科大學(xué)高職學(xué)院,遼寧沈陽 110026;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽 110016)

    本實(shí)驗(yàn)為當(dāng)歸寄生注射液指紋圖譜[1]的研究工作的一部分。當(dāng)歸寄生注射液,由當(dāng)歸和槲寄生兩味藥材組成,具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛之功效,用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥大性脊椎炎、腰膝勞損、腰腿痛、痛經(jīng)、坐骨神經(jīng)痛、神經(jīng)性頭痛等證的治療。方中當(dāng)歸為血中圣藥,具有補(bǔ)血活血、化瘀止痛、生肌健骨之功效,槲寄生具有益肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)益血之功效[2]。作者曾建立當(dāng)歸藥材的高效液相色譜指紋圖譜,為當(dāng)歸寄生注射液質(zhì)量控制提供依據(jù)[3]。近代化學(xué)成分和藥理研究表明,槲寄生主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、苷類、甾醇類等多種化學(xué)成分,具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)靜中樞等作用,同時(shí)有減少關(guān)節(jié)積液、改善關(guān)節(jié)骨端變性及骨質(zhì)疏松狀態(tài)、增寬狹窄的關(guān)節(jié)間隙等作用[4-5]。文獻(xiàn)報(bào)道,槲寄生藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法主要是紫丁香苷和齊墩果酸的含量測(cè)定[6-7]。為全面地控制藥材質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)對(duì)10個(gè)產(chǎn)地的槲寄生藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究及聚類分析。

    1 儀器與試藥

    LC-10ATvp輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器(日本島津公司),ANASTA色譜工作站(美國 Suntek Science公司),PHS-2TC精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海之信儀器有限公司),電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

    阿魏酸對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用,批號(hào):0773-9910),乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純(天津市康科德科技有限公司),冰醋酸為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)。

    槲寄生藥材(1-山東- 1;2-河北;3-山東-2;4-吉林;5-山東-3;6-山東泰安;7-遼寧鞍山;8-遼寧沈陽;9-山東五蓮縣;10-山西),由沈陽藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定,粉碎過0.45 mm篩,置于干燥陰涼處備用。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:以0.5%冰醋酸溶液(A)和甲醇-四氫呋喃(90∶10,v/v)(B)進(jìn)行梯度洗脫,程序?yàn)?~3 min,0%B;3 ~60 min,0%B ~40%B;檢測(cè)波長270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20 μL。理論塔板數(shù)以阿魏酸(20號(hào)峰)計(jì)不低于20 000。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸對(duì)照品約5.0 mg,加水制成每1 mL含50 μg阿魏酸的溶液。

    2.2.2 供試品溶液 取槲寄生藥材5 g,加水75 mL煎煮2 h,濾過,濾渣加水50 mL煎煮2 h,合并濾液,減壓蒸餾至20 mL,加乙醇80 mL,靜置48 h,濾過,減壓蒸餾至15 mL,并定量稀釋至50 mL。將上述溶液與對(duì)照品溶液1∶1(v/v)混合后,0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。

    2.3 儀器精密度試驗(yàn) 取1號(hào)藥材粉末,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,結(jié)果,各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為1.1% ~1.5%,相對(duì)峰面積RSD值為1.5%~2.9%。

    2.4 方法重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)藥材粉末,按2.2項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液,分別測(cè)定,各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為1.3%~1.9%,相對(duì)峰面積RSD值為1.7%~3.0%。

    2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號(hào)藥材粉末,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫放置,分別于 0、2、4、8、10、24 h 進(jìn)樣分析,各色譜峰相對(duì)峰面積RSD值均為1.6% ~2.9%,表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

    2.6 槲寄生指紋圖譜的繪制及共有峰的確定 取不同產(chǎn)地槲寄生藥材10批,每批1份,按2.2項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定、記錄色譜圖。通過對(duì)比上述10個(gè)不同批次和產(chǎn)地的槲寄生藥材指紋圖譜,確定22個(gè)共有峰,其中20號(hào)峰為阿魏酸,將其作為參比峰。根據(jù)各色譜峰對(duì)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間定性,各色譜峰相對(duì)參比峰的峰面積比值(X)定量。色譜圖見圖1(為5號(hào)樣品的色譜圖),相對(duì)峰面積結(jié)果見表1;各樣品出峰總數(shù)及其共有峰所占比例見表2。

    表1 槲寄生藥材指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

    圖1 槲寄生高效液相指紋圖譜

    表2 各樣品出峰總數(shù)及其共有峰所占比例

    2.7 槲寄生藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的確立

    2.7.1 系統(tǒng)聚類分析 本研究以經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的10個(gè)不同產(chǎn)地和批次的槲寄生樣品為研究對(duì)象,進(jìn)行指紋圖譜研究,獲得包括阿魏酸(20號(hào)峰)在內(nèi)的22個(gè)色譜峰。將各色譜峰相對(duì)于參比峰的峰面積量化,得到10×22階原始數(shù)據(jù)矩陣,運(yùn)用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,采用離差平方和法,利用歐氏距離作為樣品的測(cè)度。聚類分析將10個(gè)槲寄生樣品分為 2 類,其中 1、2、3、4、5、6、7、8、10 號(hào)樣品,列為

    Ⅰ類,9號(hào)樣品列為Ⅱ類。聚類譜系圖見圖2。

    圖2 槲寄生聚類譜系圖

    2.7.2 相似度計(jì)算 結(jié)合聚類分析結(jié)果,從10個(gè)槲寄生藥材中,選取9號(hào)之外的其余9批藥材的指紋圖譜建立共有模式,采用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)計(jì)算各樣品與共有模式之間的相似度。若樣品與共有模式間的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)在0.80以上,則列為Ⅰ類;若低于0.80,則列為Ⅱ類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相似度分析結(jié)果與系統(tǒng)聚類結(jié)果一致,兩種方法得到了相互驗(yàn)證。待測(cè)樣品獲取指紋圖譜數(shù)據(jù)后,計(jì)算其相似度即可評(píng)價(jià)其質(zhì)量。結(jié)果見表3。

    表3 相似度檢驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    當(dāng)歸寄生注射液高效液相色譜指紋圖譜研究已對(duì)供試品溶液制備方法及色譜系統(tǒng)進(jìn)行考察,因需進(jìn)行當(dāng)歸寄生注射液及組方藥味的相關(guān)性研究,本文采用相同的制備方法及色譜條件。

    對(duì)比10批槲寄生藥材圖譜,山東五蓮縣槲寄生樣品的圖譜明顯不同,相似度明顯低于其它批。此外,山東五蓮縣槲寄生外觀不同于其他樣品,呈扁枝狀金黃色,而其它的槲寄生藥材呈圓枝狀棕黃色。根據(jù)扁枝槲寄生的外觀性狀的鑒別條件為莖基部圓柱形,具二棱,小枝扁平,綠色,每一節(jié)間呈矩圓狀倒披針形或近條形,上寬下狹,脈兩面具多條,葉退化成鱗片狀這些特點(diǎn)后經(jīng)孫啟時(shí)教授驗(yàn)證其為扁枝槲寄生。

    除9號(hào)樣品外,10號(hào)樣品的相似度也明顯低于其他幾批樣品,如果將相似度控制在0.90,那么10號(hào)樣品也會(huì)被單獨(dú)列為一類,所以在使用類似這樣的樣品時(shí)應(yīng)慎重考慮。

    [1]于 淼,于治國,趙云麗,等.當(dāng)歸寄生注射液指紋圖譜研究[J].中成藥,2004,26(8):607-609.

    [2]李正華,詹 奇,粱 篤.補(bǔ)骨方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2004,14(4):12.

    [3]于 淼,李 飛,于治國,等.當(dāng)歸藥材中水溶性成分指紋圖譜的分析[J].中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2008,25(1):20-22.

    [4]趙 晶,賀江萍.槲寄生的化學(xué)成分及藥理作用研究[J].天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,24(3):185-186.

    [5]王 俊,王國基,顏 輝,等.槲寄生的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2005,16(4):300-303.

    [6]徐建富,杜秀寶,孔景臨,等.RP-HPLC測(cè)定槲寄生中紫丁香苷的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2004,11(2):49-50.

    [7]劉順航,王俊全,劉 巖,等.高效液相色譜法測(cè)定槲寄生中齊墩果酸的含量[J].中成藥,2008,30(6):926-928.

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